接上一篇，接着说增强ADCC的治疗手段。本篇为该综述的最后一部分。
免疫细胞因子
抗GD2免疫细胞因子
免疫细胞因子（IC）指的是连接免疫激活细胞因子和抗肿瘤单抗的融合蛋白。最早使用的IC是把IL2和ch14.18杂合抗GD2单抗的C端连接起来的融合蛋白。这样，该IC的IL2部分可以模拟游离IL2起到激活细胞增殖的作用，介导IL2受体阳性的细胞与肿瘤细胞的结合。IC还保留了FcR结合能力，从而能够介导ADCC作用。由于IC的IL2作用局限于肿瘤微环境中，增强ADCC作用的同时，引起的毒性比游离的IL2要小得多。Lode等人通过自发性神经母细胞瘤模型小鼠实验发现，这种ch14.18/IL2杂合蛋白比ch14.18联合游离IL2用药方式的抗肿瘤活性更强。他们还发现，这种抗肿瘤作用强烈依赖于NK细胞，因为一旦NK细胞缺失，抗肿瘤活性就消失了。
连接人IL2和人源化14.18单抗的人源化IC也被创造出来。已经有针对难治性神经母细胞瘤的II期临床实验在评估该IC的抗肿瘤活性。根据疾病程度的不同，病人被分成两组：第一组病人的肿瘤使用常规放射性的计算机断层扫描（CT）或磁共振成像（MR）即可检出，第二组病人只能通过123I-MIBG闪烁成像和/或BM组织学的方式检出。最终得到的有效应答的36个病人中，第一组13个病人中没有应答，而第二组23个病人中有5例完全应答。另一项关于该IC的II期临床实验中，测试了14例恶性黑色素瘤的病人，其中，1例病人表现出部分应答。两个临床实验都说明，相比一般案例，hu14.18-IL-2在存在MRD的临床案例中更为有效。而且，神经母细胞瘤II期临床实验中，第二组病人中21.7%完全应答，而所有的应答者都有KIR/KIR配体偏好（比如KIR配体缺失）。这一研究也提示在hu14.18-IL-2针对神经母细胞瘤病人的抗肿瘤作用中，NK细胞至关重要。
抗PSMA免疫细胞因子
前列腺特异性膜抗原（PSMA）是低分化前列腺癌细胞表面高表达的一种抗原，十分适合作为单抗治疗的靶点。几种抗PSMA单抗和单抗-小分子联合治疗方案在进行临床试验，一小部分病人表变出抗肿瘤应答，部分基于ADCC作用。为增强抗PSMA单抗的ADCC作用，该抗体融合了IL2形成抗PSMA IC。该IC在体外实验中表现出ADCC作用的增强，体内实验中表现出比单独使用抗PSMA单抗更强的抗肿瘤活性。后续还会进行临床前模型动物试验和临床试验，考察这种新型的IC是否有更优的抗肿瘤活性。
IL15偶联的免疫细胞因子
IL2偶联的IC的一个缺点在于IL2介导的毒性作用会限制药物的MTD（最大耐受剂量）。和IL2不同，IL15没有表现出严重的毒副作用。而且，IL15还可能会提高抗肿瘤活性。因为IL15的非游离态活性更好，科学家合成了人IL15Rα和人IL15的融合蛋白，RLI。该融合蛋白在体外和体内实验中都表现出比游离IL15更好的活化功能。Vincent等人把RLI连接到杂合抗GD2抗体（c.60C3）的末端，成为RLI连接抗GD2的IC。在体外实验中，这个IC具有和RLI一样的IL15诱导的增殖活性，也具备抗GD2单抗的诱导ADCC活性。此外，在NXS2神经母细胞瘤模型小鼠实验中，抗GD2-RLI表现出比RLI、抗GD2单抗单独或者联合作用都要好的抗肿瘤活性。同团队的残留淋巴瘤模型小鼠实验还证明了，RLI偶联利妥昔单抗比RLI联合利妥昔单抗治疗方案更能够延长小鼠的生存期。这些临床前试验数据说明IL15连接的IC比IL2连接的IC在活性和毒性方面更具有临床价值。
靶向NK细胞的新型双特异性抗体或者可变区单链分子（scFv）
随着基因改造技术的不断发展，不同于传统抗体的双特异性抗体（bsAbs）甚至三特异性抗体被构建出来。它们或者靶向肿瘤细胞的两种不同表位，或者分别结合肿瘤细胞和免疫细胞。双特异性抗体分为两类：与传统抗体类似的含有Fc段的bsAbs以及相对小很多的没有Fc段的bsAbs。为了使得肿瘤细胞和NK细胞靠的更近，科学家制造了几种可以同时结合肿瘤抗原和FcγRIIIA（CD16）的bsAbs和scFv。目前，用来治疗霍奇金淋巴瘤病人的II临床药物AFM13就是一个靶向CD30和CD16的双特异性四价抗体。体外实验中，它表现出比其他抗CD30抗体更强的毒性，而它的ADCC活性与FcγRIIIA的亚型不相关。另一个抗CD20/CD16的双特异性抗体，在体外和体内实验中也表现出比利妥昔单抗更好的清除B细胞恶性肿瘤的作用。同样的，该抗体的ADCC活性与FcγRIIIA的不同亚型也没有相关性。两种不同的CD33/CD16双特异性抗体也已被证明具有杀伤急性髓细胞白血病（AML）细胞或者AML前体细胞的活性。在体外实验中，还有一些靶向于白血病以及淋巴瘤细胞的CD19/CD16双特异性抗体或者衍生抗体，也表现出很强的ADCC活性。
实体瘤方面，靶向于HER2/CD16的双特异性抗体已经用于HER2阳性的模型小鼠体内实验，在那些HER2低表达的肿瘤中，该抗体表现出比曲妥珠单抗更强的抗肿瘤活性。有趣的是，这一双特异性抗体的活性同样不具有FcγRIIIA亚型相关性。此外，体外实验中，EPCAM/CD16双特异性scFv抗体对很多来源的恶性肿瘤都有杀伤作用，对NK依赖的肿瘤靶点也有杀伤作用。以上这些双特异性抗体都不选择性作用于NK细胞表面的某种FcγRIIIA亚型，这一特征大大扩展了可以因这种免疫治疗手段受益的病人群体。
NK细胞体外活化、增殖后再转入体内
增强NK细胞功能和ADCC的另一种手段是把在体外活化并增殖后的NK细胞输回体内。经过体外扩增，这些活化的NK细胞靶向肿瘤细胞会更高效，而且输入回病人体内也很安全。在某些情况下，相对于非同源的NK细胞，自体移植的NK细胞抗自身肿瘤的活性要更强。体外NK细胞活化和增殖有几种方式。在IL2和辐照过的饲养层细胞（EBV-LCL或者基因改造过的K562细胞）存在的情况下，NK细胞在21天里能够扩增200-400倍。经过改造后细胞表面表达IL15和41BBL的K562具有刺激NK细胞活化和增殖的作用。这种使用改造的K562刺激活化和增殖的NK细胞，在体内和体外实验中均表现出更好的抗肿瘤活性。此外，体外增殖的NK细胞仍表现出介导ADCC的作用，和抗肿瘤单抗共同作用时表现出更好的抗肿瘤活性。单独使用增殖NK细胞的治疗方案，以及和单抗联用的治疗方案目前都有临床实验在进行。这些临床实验将会回答如回输的NK细胞在体内会存活多久、它们的归巢能力以及肿瘤靶向的特异性等问题。
影响抗体/NK细胞介导的免疫治疗的基因型因素
尽管有很多包含NK细胞的免疫治疗的成功案例，仍然有病人并没有因为免疫治疗获益。确定哪些病人更容易对免疫治疗产生应答，哪些病人不敏感，无疑有重要意义。在众多癌症类型中，有很多影响免疫治疗效果的基因型因素。这里，我们主要讲述那些影响NK细胞功能以及ADCC效应的基因型。
NK细胞上的杀伤免疫球蛋白受体（KIR）及其配体
一些NK细胞和T细胞表面会表达KIR。KIR位于19号染色体，具有高多态性。人基因组中有15种功能性KIR基因和2种KIR前体基因。功能性KIR基因中，有一些是抑制型受体，有一些是激活型受体。有些KIR基因的配体研究的很清楚，这些配体对应的KIR通常识别HLA中的I型分子，不过，相对于T细胞受体来说，这种结合作用的特异性要差很多。比如说，和特异性识别T细胞受体不同，KIR可以忽略HLA隐藏在口袋中的肽链而识别I型HLA分子。一些抑制型KIR和激活型KIR胞外区域高度同源，它们共用相同的HLA配体，但抑制型KIR和HLA配体结合能力要更强。KIR和KIR配体的相互作用会影响NK细胞的成熟和功能。因为KIR表型以及KIR的表达在群体中有很大的差异性，而KIR配体的遗传与KIR没有相关性，个体的KIR/KIR配体基因型的不同对NK细胞功能以及ADCC影响很大。不同个体之间KIR/KIR配体基因型的不同导致了他们对特定免疫治疗的应答有很大的不同，尤其是对那些包含NK细胞的免疫治疗手段。
进行异源造血细胞移植的AML病人案例中，通过分析供者NK细胞的KIR单倍体以及供者抑制型KIR与受者KIR配体基因型的关系可以预测临床效果；KIR和KIR配体基因型，即使不是全部，也部分地影响急性淋巴细胞白血病病人的造血细胞移植治疗效果。相对于没有缺失KIR配体基因的患者，缺失KIR配体基因的病人在接受没有缺失同样基因的供者的造血细胞之后，表现出更长的无进展生存期。在高危神经母细胞瘤病人的自体造血细胞移植实验中，Venstrom等人发现，那些缺失了自身抑制型KIR配体的病人表现出更长的无进展生存期和整体生存期。即使这些癌症病人的移植案例中不包含直接的ADCC作用，数据中的KIR/KIR-L关系也表明NK细胞对移植后的抗肿瘤应答意义重大。
在那些包含ADCC作用的免疫治疗案例中，缺失了自身抑制型KIR配体的病人仍然有更好的临床表现。抗GD2单抗或者IC治疗的神经母细胞瘤病人，以及利妥昔单抗治疗的淋巴瘤病人中，缺失了抑制型KIR配体的病人临床表现也要更好。这些发现表明，自身KIR/KIR-L基因型不仅影响NK细胞的功能同样影响临床上NK细胞介导的ADCC效应。
抑制型KIR/KIR-L相互作用影响NK细胞功能的效应研究已经有几十年了，激活型KIR/KIR-L相互作用在NK细胞相关的免疫治疗中的作用直到最近才有报道。2011年，Scquizzato等人考察了一组接受异体造血干细胞移植的恶性造血肿瘤病人，并评估了病人KIR配体缺失、供者抑制型KIR或者激活型KIR缺失对治疗的影响。他们发现，只有在把缺失KIR配体病人接受了相应激活型KIR供者移植的案例从分析中去除，才能够得出缺失相应KIR配体的病人获得了更长的无病生存期的结论。这一研究意味着，激活型KIR/KIR-L相互作用对病人临床应答的影响与抑制型KIR/KIR-L相互作用对病人临床应答的影响模式完全不同，不能够放在一起分析。
2012年，Venstrom等人报道了一组较大样本量的接受了异体移植的AML病人的临床数据，那些供者有激活型KIR基因，KIR2DS1，以及两个拷贝相应的配体HLA-C2的病人，与供者有KIR2DS1却只有一个拷贝或者没有HLA-C2的病人相比，复发率更高。与这一临床结果相一致的，Pittari等人也发现，和没有或者只有一个拷贝HLA-C2的供者来源的KIR2DS1阳性NK细胞相比，来源于有两个拷贝HLA-C2供者的KIR2DS1阳性NK细胞对肿瘤靶点应答率要低。临床和体外数据都证明，KIR2DS1阳性的NK细胞会因为两个拷贝的同源配体长时间的刺激而降低免疫应答。而这种低应答对病人接受单抗治疗触发FcγR激活NK继而介导ADCC的影响还在研究之中。由于激活型KIR与其配体相互作用的研究还远不及抑制型KIR与其受体相互作用研究那么广泛，很多性质还需要更多实验数据的支撑。期待在未来，抑制型KIR/KIR-L基因型相互作用以及激活型型KIR/KIR-L基因型相互作用，可以作为预测临床效果的有力指标。
NK细胞Fc受体基因变异
FcγR可以与免疫球蛋白的Fc段结合，借此把免疫系统和体液系统联系起来。人体有三种类型的FcγR，分别为FcγRI、FcγRII和FcγRIII。这三种受体由不同的免疫细胞表达。NK细胞表达FcγRIIC和FcγRIIIA两种受体，因FcR多态性以及IgG亚型的不同，这两类受体和IgG的亲和力或弱或中等。如前所述，有完整免疫系统的个体大部分的NK细胞表达有FcγRIIIA，一半的个体NK细胞表达FcγRIIC。FcγRIIC和FcγRIIIA都存在基因变异，这种变异会导致该受体的表达量以及与IgG亲和力的不同。
前面也提到过，实验发现一些组的病人的FcγRIIIA-158位点的SNP与病人应答呈相关性；与IgG亲和力最强的V/V基因型应答也最好。事实上，FcγRIIIA-158-V对IgG1——单抗免疫治疗中最常用的IgG亚型——的亲和力更强。有趣的是，FcγRIIIA-158-V和FcγRIIIA-158-F对IgG3比IgG1的亲和力更好。这提示IgG亚型的不同可能会提高与NK细胞相互作用的不同，进而产生对肿瘤细胞更大的杀伤力。不过，其他免疫细胞会表达其他FcRs（如Fcwever），如中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞等，它们在肿瘤杀伤中也起到关键作用，而它们也表现出对IgG3的亲和力比对IgG1更强。
NK细胞表达的另一种FcγR，FcγRIIC，也表现出对IgG3比IgG1的亲和力更强。FcγRIIC是介于FcγRIIA（骨髓免疫细胞表达的激活型FcR）和FcγRIIB（B细胞、单核细胞、巨噬细胞表达的抑制型FcR）之间的一种存在。FcγRIIC也有一个SNP，控制它表达或者不表达。FcγRIIC外显子3有一个SNP位点，要么是一个开放阅读框，表达FcγRIIC，要么是一个终止子，那么细胞表面就没有FcγRIIC表达。20%~40%的个体会表达FcγRIIC，而FcγRIIC与FcγRIIIA共表达会增强NK细胞的ADCC作用。
一些FcγR还表现出拷贝数的变异（CNV），这种CNV也会导致细胞表面FcR表达的变化。FcγRIIC和FcγRIIIA都有CNV影响表达量的变化，进而影响NK细胞活化以及ADCC作用。
综上所述，FcγRIIIA亚型会影响结合IgG能力、FcγRIIC在不同人群中表达量有差异、FcγR还存在CNV，基于FcγR基因型的不同，采用基因检测手段，事先挑选出合适免疫治疗的病人对于未来临床研究非常重要。更为详细地对这三种基因（FcγRIIA、FcγRIIC和FcγRIIIA）多态性和CNV与临床免疫治疗结果的相关性研究已经在考察中。当然，这些在体内实验中影响ADCC作用的因素，势必在诱导ADCC的单抗临床治疗中发挥重要作用。
结论
单抗采用很多机制摧毁肿瘤，其中之一就是ADCC。从最开始的鼠源的单抗，到杂合单抗，到人源化单抗，再到完全的人源单抗，肿瘤领域的单抗治疗手段还在一步步进化。除了优化单抗本身，还有一些其他的增强抗肿瘤活性的手段，比如提高ADCC效应，单抗与激活的免疫系统共同作用。因为NK细胞是单抗介导ADCC的主要效应细胞，能够增强NK细胞活化的试剂，如IL2，可以与单抗联合作用以提高ADCC作用。但是，因为IL2的毒副作用太大，科学家们采用了新型的IC治疗手段降低毒副作用，以提高最大给药浓度。IL15作为可以激活NK细胞的一种细胞因子被越来越多地应用到各种肿瘤治疗的临床实验之中。除了细胞因子或者IC， 能够阻止FcR关闭的MMP抑制剂、放射线疗法的应用也使得肿瘤对免疫治疗更加敏感/脆弱。单抗与这些手段的联合应用治疗方案正在开发当中，以期获得更好的抗肿瘤效果。最后，特定病人的NK细胞受体表达图谱也会影响NK细胞介导的ADCC作用。特别是KIR和FcR的基因型可能会帮助预测单抗免疫治疗的临床结果，进而推动个性化治疗。为了预测结果更有参考价值，还需要对NK细胞表型与临床结果相关性做更为详细的考察。
END