磷酸化蛋白的WB检测是信号通路研究中的经典方法。细节决定成败，在科研中更是如此，本文详细讲述了实际操作过程中应该注意的事项，分享出来方便大家学习。
1. 一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使 band 压出来也会很浅，结果也不可信。
2. 加一抗后最好 4 度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。 二抗则室温 1 小时即可。
3. 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。务必找专业的磷酸化抗体公司订购。
4. 最好根据厂商的 protocol 来操作实验，这是实验成功的保证。
5. 抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。
6. 研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完 phospho-p38 抗体后，我会把相同的 membrane 做 strip 后再压 p38, 然后再 strip 一次，再压内标 actin 。
7. 做磷酸化蛋白 WB 时，除了目标蛋白的 band 以外，往往会出现非特异性的 band. 磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的 band, 而没有你想要的 band, 所以压片以后，一定要根据 markers 比对一下，压出的 band 分子量是否正确。
8. 磷酸化蛋白 WB 时 backgroud 也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则 backgroud 太深盖住想要的那条 band, 时间过短则可能没有 band 或者 band 太浅。
9. 磷酸化蛋白 WB 时，要用TBST，不能用PBST。用 TBST 洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗 5min 3 次即可，宁愿 background 深一些，总比做不出来强得多 . 另外，洗的时候，最好不要把几张 membrane 叠在一起洗。
10. 正如第 5 点所说的 ,“研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量 ”。这有两种方法，一是：相同的 sample 在不同的 well 中上样两次，可在相同的gel上，也可在不同的gel。其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个 gel ，压内标。但是本人不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，本人也建议如此的方法，即：将原先结合上的磷酸化抗体及二抗用 strip solution 洗去，
11. 方法如下 :50 度水浴 30min 后，用 TBST 洗 5 分钟 ,3 次即可去除已孵育结合的抗体。许多人会建议 55 度水浴 30min。Strip solution 是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。我本人经实验发现水浴时有时温度不稳定，温度定为 55 度时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为 50 度 30min ，既能有效去除已结合的抗体，又比 55 度更能保护蛋白 .
12. Strip 时一定要注意： membrane 一定要完全泡在 strip solution 中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀 。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。我曾将同一张 membrane 用我提供的方法 strip 了 3 次，分别压不同的抗体（因为有时候蛋白分子量很接近），效果都不错。
13. 附个Stripping Buffer配方以供参考：
Mild stripping Buffer, 1 liter
15g Glycine
1g SDS
10ml Tween 20
Adjust pH to 2.2
Bring volume up to 1 L with ultrapure water.