Nature：基因组编辑工具CRISPR的进化史

CRISPR tool enables precise genome editing

作者：Randall J. Platt

基因组编辑的最终目标是能够对生命蓝图做出任何具体的改变。基因组编辑的“搜索-替换”方法使我们朝着这个宏伟目标迈出了一大步。


构成生命蓝图的脱氧核糖核酸序列的变异对任何物种的适应性都是至关重要的，然而成千上万的脱氧核糖核酸变异被认为会导致疾病。经过几十年的遗传学和分子生物学研究，在开发基因组编辑工具来纠正这种改变方面已经取得了巨大的进展。但是，由于工具依赖于复杂和竞争的细胞过程，基因编辑的效率和精确度似乎达到了一个基本的极限。在《Nature》杂志上，Anzalone等人描述了“搜索-替换”基因组编辑，其中两个分子机器的结合使得基因组能够被精确地改变。这项技术对生物医学科学有着直接而深远的影响。

人类改造基因组的努力比基因甚至遗传来源的知识更早。第一次基因组工程依赖于自然变异和通过选择性育种的人工选择。例如，现代玉米(玉米)是9000多年前通过人工选择从其野生祖先teosinte改造而来的。后来的进展是由认识到脱氧核糖核酸序列决定生命，进化可以通过使用诱变剂，如辐射或化学物质来增强和人工加速。

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接下来的发现是，修复基因序列错误的细胞过程可能被劫持，允许外来“模板”基因的序列在基因断裂时插入基因组。如果基因被故意破坏，这个过程会大大加强——这一发现引发了20多年来对一种酶的研究，这种酶可以在感兴趣的位置特异性切割基因。在采用细菌CRISPR-Cas9系统时搜索范围达到了最高点，其中酶Cas9使用可定制的核糖核酸来指导搜索要在人类细胞中切割的脱氧核糖核酸序列**(****图1a)**。

CRISPR-Cas9通过让所有研究人员都能进行基因组编辑，引发了生物医学科学的一场革命，但最终，它只是一把切割脱氧核糖核酸的花哨的分子剪刀。因为脱氧核糖核酸的切割对细胞来说是致命的，所以急需通过许多独立途径中的一种来修复。在基因组编辑的背景下，期望的结果是修复由模板脱氧核糖核酸指导，导致精确的编辑。但是大多数细胞更喜欢使用另一种机制，即忽略脱氧核糖核酸模板，将脱氧核糖核酸的两端不完全缝合在一起——这是基因组编辑的一个主要限制。

在过去几年里，很多努力都集中在将平衡从不完美转变为精确编辑上。一个有效的策略是编辑脱氧核糖核酸而不切断螺旋中的两条脱氧核糖核酸链——双链断裂是导致不完美编辑的主要因素。这方面的一个里程碑是碱基编辑的发展，在这个过程中，一种只切割一个DNA链的Cas9酶与一种能在缺口附近将一个特定的DNA碱基转换成另一个特定的碱基的酶结合**(****图1b)**。然而，碱基编辑的技术限制，以及修改不仅仅是单个碱基的需要，意味着仍然迫切需要新的基因组编辑方法。

Anzalone及其同事们现在主要用一种叫做prime editing的技术来满足这种需求。他们的方法依赖于混合分子机器由修改版的Cas9和逆转录酶组成，前者只切割两条脱氧核糖核酸链中的一条，后者在切割位点安装新的可定制的脱氧核糖核酸(图1c)。这种结合与酵母中自然发生的过程相似，在酵母中，对应于核糖核酸序列的脱氧核糖核酸通过逆转录酶被整合到基因组中。

**图1 |基因组编辑技术的演变。**a、在常规基因组编辑中，Cas9酶被导向核糖核酸导向基因组中的一个位置，并产生双链断裂。宿主细胞的脱氧核糖核酸修复机制在模板脱氧核糖核酸的引导下修复断裂，将模板序列整合到双链体中。**b、**在一种叫做碱基编辑的方法中，只产生单链断裂(缺口)的Cas9与脱氨酶一起工作。脱氨酶化学修饰特定的脱氧核糖核酸碱基——在这里，胞苷碱基转化为尿嘧啶。然后，脱氧核糖核酸修复修复缺口，将鸟嘌呤-尿嘧啶中间体转化为腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基对。这种方法比a更精确，但只进行单核苷酸编辑。**c、**Anzalone等人报告了prime editing，它可以精确地编辑脱氧核糖核酸序列。产生缺口的Cas9和逆转录酶产生缺口的脱氧核糖核酸，其中结合了对应于导向核糖核酸的序列。原始的脱氧核糖核酸序列被切断，然后脱氧核糖核酸修复固定缺口链，产生完全编辑过的双链体。在某些情况下，在脱氧核糖核酸修复步骤(未示出)之前，在双链体的未编辑链上产生另一个缺口。


Prime-editing的编辑过程是由一个由两部分组成的工程核糖核酸引导编排的。引导中的“搜索”部分将Cas9引向脱氧核糖核酸靶中的特定序列，在那里它切割两条脱氧核糖核酸链中的一条。反转录酶随后产生与核糖核酸引导“替换”部分序列完全一致的脱氧核糖核酸，并将其安装在切割的脱氧核糖核酸末端之一，在那里取代原始脱氧核糖核酸序列。

此时，被修饰的双链体由两条非互补链组成：被编辑的链和未被Cas9切割的完整链。非互补序列在细胞中是不可容忍的，因此其中一条链必须通过脱氧核糖核酸修复过程固定，以匹配另一条链，完整的链通常优先保留。因此，作者通常不得不使用第二个向导核糖核酸来指导完整链的切割，以增加该链被修复以匹配编辑序列的机会。切割必须有策略地进行，以避免在同一时间或地点断裂两条链。

Anzalone等人通过使用prime编辑来高效、精确地安装各种序列，展示了prime编辑的多功能性转化为脱氧核糖核酸。例如，他们在体外人类胚胎肾细胞中使用它来纠正导致血液疾病镰状细胞病的突变，并编辑导致神经疾病的突变。不完美的编辑几乎完全避免了。作者还在体外对人类癌细胞和小鼠神经元进行了编辑。

几十年来，基因组编辑的潜力一直被精确修改的困难所限制，因此应用集中在不完美的脱氧核糖核酸编辑是有用的情况。例如，这种编辑可以用来削弱基因的功能，为理解其功能提供一种途径。现在，prime编辑使安装或校正一个或多个特定突变(如在人类患者中发现的突变，或对研究有用的合成序列)比以前更快、更容易。它使更多的细胞类型可供操作，这是前所未有的。束缚基因编辑的链条就这样脱落了——毫无疑问，这加快了研究的步伐，并促成了一系列新的应用。

然而，prime编辑有局限性。首先，在prime编辑组件之间发生的复杂的多步分子改变还不可预测，也不总是如预期的那样。因此，仍然会出现不完美的随机编辑，这意味着可能需要测试几个组件的组合，以计算出感兴趣的每个编辑所需的编排。第二，将prime编辑系统传递到某种细胞类型中可能很有挑战性，因为许多以前的尝试都在传统的Cas9系统上失败了，而Cas9系统大约只有其一半大小。

出于研究目的，这些限制大多不方便，可能会通过旨在更好地理解和微调方法的后续工作来克服。然而，对于医学应用来说，这些问题提出了更大的挑战——不完美的脱氧核糖核酸编辑是不可接受的，高效地将原始编辑系统传递给细胞将是至关重要的。因此，尽管prime编辑的确有潜力让我们对生命蓝图拥有前所未有的控制权，但只有时间才能证明它是成为CRISPR工具箱中的另一个工具，还是遗传疾病的万灵药。

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参考文献

1. Anzalone, A. V. et al. Nature https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4 (2019).

2. Matsuoka, Y. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 6080–6084 (2002).

3. Capecchi, M. R. Science 244, 1288–1292 (1989).

4. Rudin, N., Sugarman, E. & Haber, J. E. Genetics 122, 519–534 (1989).

5. Rouet, P., Smih, F. & Jasin, M. Mol. Cell. Biol. 14, 8096–8106 (1994).

6. Jinek, M. et al. Science 337, 816–821 (2012).

7. Cong, L. et al. Science 339, 819–823 (2013).

8. Mali, P. et al. Science 339, 823–826 (2013).

9. Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Nature 533, 420–424 (2016).

10. Keskin, H. et al. Nature 515, 436–439 (2014).

11. Platt, R. J. et al. Cell Rep. 19, 335–350 (2017).

12. Cox, D. B. T., Platt, R. J. & Zhang, F. Nature Med. 21, 121–131 (2015).