一个R包玩转单细胞免疫组库分析，还能与Seurat无缝对接

单细胞免疫组库数据分析

NGS系列文章包括NGS基础、转录组分析 （Nature重磅综述|关于RNA-seq你想知道的全在这）、ChIP-seq分析 （ChIP-seq基本分析流程）、单细胞测序分析 (重磅综述：三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程 （原理、代码和评述）)、DNA甲基化分析、重测序分析、GEO数据挖掘（典型医学设计实验GEO数据分析 (step-by-step) - Limma差异分析、火山图、功能富集）等内容。

在介绍clonotypr(https://github.com/mattfemia/clonotypr)包之前，我们需要先去解决几个问题：

（1）为什么要进行单细胞免疫组库的分析？

• 应用方向一：探索肿瘤免疫微环境，辅助免疫治疗。

每个人都拥有一个自己的适应性免疫组库，TCR和BCR通过基因重组和体细胞突变取得多样性，使得我们身体可以识别和抵御各种内部和外部的入侵者。而肿瘤的发生往往躲避了人体T淋巴细胞而产生、增殖和转移。

使用10X Genomics ChromiumTM Single Cell Immune Profiling Solution可以捕捉肿瘤发生时的免疫微环境变化，寻找免疫治疗的靶点，从而辅助免疫治疗更好地抗击肿瘤。

• 应用方向二：探索自身免疫性疾病和炎症性疾病发生机制，辅助疫苗的研究

自身免疫性疾病发生起始和发展的中心环节被认为是抗原特异性T细胞激活导致的，使用10X Genomics ChromiumTM Single Cell Immune Profiling Solution，可以解析自身免疫性疾病的发病机制，从而为疾病的诊疗提供依据。

• 应用方向三：移植和免疫重建

器官或者骨髓移植时，经常会诱发宿主的排斥反应，从而发生慢性移植抗宿主病。同种异体反应随机分布在整个T细胞组库的交叉反应，因此延迟T细胞恢复和限制的T细胞受体多样性与异体移植后感染和疾病复发风险增加相关。

而我比较注意的是在疫苗接种前后BCR/TCR CDR3免疫组库的分析，最近medRxiv上发表的有关新冠的文献Immune Cell Profiling of COVID-19 Patients in the recovery stage by Single-cell sequencing中对不同BCR/TCR的VDJ重排进行分析，揭示针对新冠特异的克隆扩增。

（2）免疫组库主要包括哪几个方面？

T淋巴细胞（T cell）和B淋巴细胞（B cell）主要负责适应性免疫应答，其抗原识别主要依赖于T细胞受体（T cell recptor, TCR）和B细胞受体（B cell recptor, BCR），这两类细胞表面分子的共同特点是其多样性，可以识别多种多样的抗原分子。BCR的轻链和TCRβ链由V、D、J、C四个基因片段组成，BCR的重链和TCRα链由V、J、C三个基因片段组成，这些基因片段在遗传过程中发生重组、重排，组合成不同的形式，保证了受体多样性。其中变化最大的就是CDR3区。

（3）10X Genomics在进行VDJ测序时为什么从5’端开始？

我们都知道3’端首先捕获的是polyA尾，然后其实就是C段恒定区，由于长度限制难以对VDJ段进行测序。（但其实我们在进行10X Genomics3’测序时，也可以发现一些IGH类的基因表达。。。）

（4）10× Genomics进行cellranger后的输出形式是什么样的？

Outputs:
- Run summary HTML:                                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/web_summary.html
- Run summary CSV:                                   /home/jdoe/runs/sample345/outs/metrics_summary.csv
- All-contig FASTA:                                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.fasta
- All-contig FASTA index:                            /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.fasta.fai
- All-contig FASTQ:                                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.fastq
- Read-contig alignments:                            /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.bam
- Read-contig alignment index:                       /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig.bam.bai
- All contig annotations (JSON):                     /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig_annotations.json
- All contig annotations (BED):                      /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig_annotations.bed
- All contig annotations (CSV):                      /home/jdoe/runs/sample345/outs/all_contig_annotations.csv
- Filtered contig sequences FASTA:                   /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_contig.fasta
- Filtered contig sequences FASTQ:                   /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_contig.fastq
- Filtered contigs (CSV):                            /home/jdoe/runs/sample345/outs/filtered_contig_annotations.csv
- Clonotype consensus FASTA:                         /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.fasta
- Clonotype consensus FASTA index:                   /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.fasta.fai
- Clonotype consensus FASTQ:                         /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.fastq
- Concatenated reference sequences:                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/concat_ref.fasta
- Concatenated reference index:                      /home/jdoe/runs/sample345/outs/concat_ref.fasta.fai
- Contig-consensus alignments:                       /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.bam
- Contig-consensus alignment index:                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus.bam.bai
- Contig-reference alignments:                       /home/jdoe/runs/sample345/outs/concat_ref.bam
- Contig-reference alignment index:                  /home/jdoe/runs/sample345/outs/concat_ref.bam.bai
- Clonotype consensus annotations (JSON):            /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus_annotations.json
- Clonotype consensus annotations (CSV):             /home/jdoe/runs/sample345/outs/consensus_annotations.csv
- Clonotype info:                                    /home/jdoe/runs/sample345/outs/clonotypes.csv
- Barcodes that are declared to be targeted cells:   /home/jdoe/runs/sample345/out/cell_barcodes.json
- Loupe V(D)J Browser file:                          /home/jdoe/runs/sample345/outs/vloupe.vloupe

clonotypr

clonotypr是一个R包，旨在使用Seurat（单细胞分析Seurat使用相关的10个问题答疑精选！）作为“骨干”，将V（D）J-seq/单细胞免疫谱数据与scRNA-seq数据的分析连结在一起。除了将克隆型数据附加到对象之外，clonotypr还提供了分析CDR3aa长度、化学组成和频率，以及将单链克隆型重新分配给其'productive'-relatives的策略。

安装

if (!require("devtools")) {
  install.packages("devtools")
}

install.packages("devtools")
devtools::install_github("mattfemia/clonotypr")

library(clonotypr)

library(kableExtra) # 数据表格格式化

clonotypr建立在Seurat对象基础上，其中seurat示例对象如pbmc_vdj 和pbmc_null都已内置于包中。

• pbmc_null ->不包含克隆型数据。

• pbmc_vdj ->在meta.data中包含克隆型数据。

用于构建“pbmc_null”和“pbmc_vdj”的数据均来自人PBMC，由10X Genomics提供。可在https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/datasets/3.1.0/vdj_v1_hs_pbmc3找到有关样本、scRNA-seq和VDJ库的更多信息。

处理数据

AddClonotypes（）和LoadClonotypes（）是clonotypr的典型函数：

• LoadClonotypes（）：

  创建一个新的数据框，不需要Seurat对象。

• AddClonotypes（）：

  将克隆型数据追加到Seurat对象中。

后面的函数将以Seurat为对象进行输入，并且都需要CellRanger输出中的两个文件：

1. filtered_contig_annotations.csv

2. clonotypes.csv

可以使用两个参数将文件进行调用：

1. 上传带有directory参数的目录

2. 使用clonotypeFile（clonotypes.csv）和filteredContigFile（filtered_contigs_annotations.csv）上传文件

我们从Seurat对象开始：

head([email protected])

[email protected] —— 增加clonotype data之前:

head([email protected]) %>% # <-- Can also be accessed with pbmc_vdj[[]]
  kable() %>%
  kable_styling(bootstrap_options = c("striped", "hover", "condensed", "responsive"), font_size = 13) %>%
  row_spec(0, bold = T, color = "black", background = "white")  %>%
  scroll_box(width = "100%", height = "250px") #生成数据表

AddClonotypes（） —— 加上clonotype data：

clonoFile <- system.file("extdata", "vdj_v1_hs_pbmc3_t_clonotypes.csv", package = "clonotypr")
fcaFile <- system.file("extdata", "vdj_v1_hs_pbmc3_t_filtered_contig_annotations.csv", package = "clonotypr")
clono <- AddClonotypes(pbmc_null,
                      clonotypeFile = clonoFile,
                      filteredContigFile = fcaFile) # Individual file upload

head([email protected]) #可以看到已将两个csv表加入clono中；

orig.ident nCount_RNA nFeature_RNA          barcode clonotype_id  v_gene d_gene
AAACCTGTCAACGGGA SeuratProject       5433         1470 AAACCTGTCAACGGGA clonotype104 TRAV9-2   None
AAACGGGGTTAAAGAC SeuratProject       3226         1147 AAACGGGGTTAAAGAC  clonotype32   TRBV9   None
AAAGATGAGTCACGCC SeuratProject       7432         1958 AAAGATGAGTCACGCC clonotype113 TRBV7-6   None
AAAGATGCAGCTGCAC SeuratProject       7105         2014 AAAGATGCAGCTGCAC clonotype114 TRAV8-3   None
AAAGATGCAGTAGAGC SeuratProject       6313         1504 AAAGATGCAGTAGAGC clonotype115  TRAV19   None
AAAGATGCATCCGTGG SeuratProject       3541         1364 AAAGATGCATCCGTGG clonotype116 TRAV1-2   None
                  j_gene c_gene                                                                 cdr3s_aa
AAACCTGTCAACGGGA  TRAJ38   TRAC                                  TRA:CALSGFHNAGNNRKLIW;TRB:CASSLILRGEQFF
AAACGGGGTTAAAGAC TRBJ1-1  TRBC1                                                        TRB:CASKGETNTEAFF
AAAGATGAGTCACGCC TRBJ1-1  TRBC1                TRA:CALSEARAAGNKLTF;TRA:CAVRDFIGFGNVLHC;TRB:CASSVGQITEAFF
AAAGATGCAGCTGCAC  TRAJ42   TRAC TRA:CAAMDSNYQLIW;TRA:CAVDPDYGGSQGNLIF;TRB:CASSLDYEQYF;TRB:CASSLSSGANVLTF
AAAGATGCAGTAGAGC  TRAJ30   TRAC                                  TRA:CALSEASRDDKIIF;TRB:CASSPDWRGDTDTQYF
AAAGATGCATCCGTGG  TRAJ33   TRAC                                      TRA:CYSMDSNYQLIW;TRB:CAISSGRAADIQYF
                                                                                                                                                                                           cdr3s_nt
AAACCTGTCAACGGGA                                                                                TRA:TGTGCTCTGAGTGGTTTCCATAATGCTGGCAACAACCGTAAGCTGATTTGG;TRB:TGTGCCAGCAGTTTAATACTCAGGGGTGAGCAGTTCTTC
AAACGGGGTTAAAGAC                                                                                                                                        TRB:TGTGCCAGCAAGGGGGAAACGAACACTGAAGCTTTCTTT
AAAGATGAGTCACGCC                                    TRA:TGTGCTCTGAGTGAGGCAAGGGCTGCAGGCAACAAGCTAACTTTT;TRA:TGTGCTGTGAGAGACTTTATAGGCTTTGGGAATGTGCTGCATTGC;TRB:TGTGCCAGCAGCGTCGGACAGATCACTGAAGCTTTCTTT
AAAGATGCAGCTGCAC TRA:TGTGCTGCCATGGATAGCAACTATCAGTTAATCTGG;TRA:TGTGCTGTGGACCCCGATTATGGAGGAAGCCAAGGAAATCTCATCTTT;TRB:TGCGCCAGCAGCTTGGATTACGAGCAGTACTTC;TRB:TGTGCCAGCAGTCTCTCTTCTGGGGCCAACGTCCTGACTTTC
AAAGATGCAGTAGAGC                                                                                TRA:TGTGCTCTGAGTGAGGCTAGCAGAGATGACAAGATCATCTTT;TRB:TGTGCCAGCAGTCCCGACTGGCGGGGGGACACAGATACGCAGTATTTT
AAAGATGCATCCGTGG                                                                                            TRA:TGCTATTCCATGGATAGCAACTATCAGTTAATCTGG;TRB:TGTGCCATCTCTAGCGGGCGAGCCGCAGACATTCAGTACTTC

head([email protected]) %>%
  kable() %>%
  kable_styling(bootstrap_options = c("striped", "hover", "condensed", "responsive"), font_size = 13) %>%
  row_spec(0, bold = T, color = "black", background = "white")  %>%
  scroll_box(width = "100%", height = "250px")

克隆型链

DescribeClonotypes可以快速检查样本中克隆型链类型的分布。

DescribeClonotypes(clono)

频率分析

与filtered_contig_annotations.csv文件中的数据相似，clonotypr计算相对于总样本群体的每种克隆型的原始频率和百分比。

freqs <- MakeFrequencyDF(clono)
head(freqs)

freqs[freqs$clonotypeVector[35:45],]
nrow(freqs)

freqs[freqs$clonotypeVector[35:45],] %>%
  kable() %>%
  kable_styling(bootstrap_options = c("striped", "hover", "condensed", "responsive"), font_size = 13) %>%
  row_spec(0, bold = T, color = "black", background = "white")  %>%
  scroll_box(width = "100%", height = "250px")
nrow(freqs)

单链克隆

clonotypr还可以处理遇到仅包含α或β链的克隆型的可能情况。那么我们就该想，不是说好的α和β链嘛，为什么只有一条，于是这是10X官方的解释：

在克隆型频率要求样本内具有高精度的情况下，JoinSingleChains可以解决此问题。在此，首先分离各个CDR3alpha和CDR3beta链。然后将那些单链克隆型的频率添加到productive克隆型的频率中，最后仅返回productive克隆型和频率。

prod_freqs <- JoinSingleChains(clono)

prod_freqs[prod_freqs$clonotypeVector[35:45],]
nrow(prod_freqs)

prod_freqs <- JoinSingleChains(clono)
prod_freqs[prod_freqs$clonotypeVector[35:45],] %>%
  kable() %>%
  kable_styling(bootstrap_options = c("striped", "hover", "condensed", "responsive"), font_size = 13) %>%
  row_spec(0, bold = T, color = "black", background = "white")  %>%
  scroll_box(width = "100%", height = "250px")
nrow(prod_freqs)

CDR3 Lengths

CDR3链长度可以使用clonotypr进行分析：

• AnalyzeCDR3Length（）->表格输出

• PlotLengths（）->可视化输出

长度表

生成将细胞barcodes与频率数据合并的表格：

barcodefreqs <- GetBarcodeFreqs(clono)

lengths <- AnalyzeCDR3Lengths(barcodefreqs, productive=TRUE)

head(lengths)

Plotting Lengths

length_dist <- PlotLengths(lengths)
length_dist[1] # CDR3alpha lengths
length_dist[2] # CDR3beta lengths
length_dist[3] # Combined lengths

CDR3氨基酸组成

要分析样品的氨基酸组成，我们可以按CDR3长度将其分解，然后关注每个氨基酸位置以研究其多样性。

clonotypr提供了两种用于CDR3组成分析的方法：

• AnalyzeCDR3aa（）->表格输出

• PlotCDR3aa（）->可视化输出

CDR3位置矩阵

“AnalyzeCDR3aa”创建一个位置矩阵，并返回一个数据框列表（而不是矩阵）。这些提供了不同长度的CDR3序列之间氨基酸组成的定量测量。在此处详细了解详情：https://en.wikipedia.org/wiki/Position_weight_matrix

三个“输出”选项：

• 位置频率矩阵（PFM）

• 位置概率矩阵（PPM）

• 位置权重矩阵（PWM）

matrices <- clonotypr::AnalyzeCDR3aa(clono, chain = "alpha", pseudocount = 1, output = "PPM") # 位置概率矩阵

matrices[[4]]

绘制CDR3组成

我们可以使用PlotCDR3aa将位置权重矩阵（PWM）作为seqlogos进行分析（R语言 - 绘制seq logo图）。此输出可用于可视化整个样本中所有长度序列的序列概率：

comp <- PlotCDR3aa(lengths)
comp[1] # <- CDR3alpha chains
comp[2] # <- CDR3beta chains

绘制CDR3位置矩阵

尽管位置计算已经集成到了函数“AnalyzeCDR3aa”中，但clonotypr允许以下方式来简化每种位置矩阵的计算：

• BuildPFM（）->位置频率矩阵列表

• BuildPPM（）->位置概率矩阵列表

• BuildPWM（）->位置权重矩阵列表

这些函数和“AnalyzeCDR3aa”输出的表格都可以绘制位置矩阵的热图，并且每种类型的矩阵都提供有单独的函数：

• PlotPFM（）-> PFM热图列表

• PlotPPM（）-> PPM热图列表

• PlotPWM（）-> PWM热图列表

matrices <- BuildPPM(data=pbmc_vdj, chain="alpha", pseudocount=1)
plots <- PlotPPM(matrices = matrices)
plots[[6]]

校对：生信宝典

参考

• 10X Genomics单细胞测序全新升级，一次实验同时玩转单细胞转录组和单细胞免疫组库：

  http://www.bioon.com.cn/news/showarticle.asp?newsid=74423

• clonotypr：

  https://github.com/mattfemia/clonotypr

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