Nature：肠道细菌能够调节果蝇运动行为

Schretter, C.E., Vielmetter, J., Bartos, I., Marka, Z., Marka, S., Argade, S., and Mazmanian, S.K. (2018). A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature 563, 402-406.

大家上午好，占用大家一些时间，跟大家分享一下这篇文章。这篇文章的题目是：肠道细菌能够调节果蝇运动行为

首先介绍一下本篇文章的通讯作者：
Sarkis K. Mazmanian，加州理工学院微生物学教授，首席研究员，实验室发表了多篇关于肠道微生物的CNS文章。
他们的实验室首次证明肠道细菌可以指导免疫系统的发育，并控制动物模型中的复杂行为;证明了哺乳动物的健康不可避免地依赖于与微生物共生。他们通过基因组学，微生物学，免疫学，神经生物学和动物模型，希望定义共生细菌参与疾病的分子过程。最终，了解有益肠道微生物与免疫和神经系统之间相互作用的机制，为人类疾病提供天然疗法。今天我分享的这篇文章就是他们实验室在2018年10月份发表在Nature上的一篇文章。

这篇文章的研究背景; 对动物行为生物学的研究目前主要集中在中枢神经系统，但外周组织和环境也与大脑的发育和功能有关。有大量证据表明，肠道和大脑之间的双向交流会影响宿主焦虑，认知，伤害感受和社交互动等一系列行为。协调的运动行为对动物的存活和繁殖至关重要，但是目前，关于肠道微生物组如何影响宿主运动，以及内部所涉及的分子和细胞机制还知之甚少。那么这篇文章的科学问题就是探究肠道微生物与宿主的相互作用对宿主运动行为的影响，以及如何影响。
温暖,具有保护,有全面的营养物质的微小的果蝇肠道是一些细菌完美的栖息地。作者选取果蝇为研究对象，研究宿主果蝇与肠道微生物组的相互作用对它运动行为的影响。

简要概括一下这篇文章的研究思路：我认为主要可以分为3个部分。Whether 首先确定肠道微生物是否会影响果蝇的运动行为？其次，which 如果影响，是哪些微生物或者哪一种微生物发挥的作用？最后,how ,探究该微生物是如何影响果蝇的运动行为。

在讲结果之前呢，我想先把文章的大结论给大家明确一下。
将无菌和有菌果蝇的运动比较，发现无菌果蝇运动更快；说明肠道微生物可以影响果蝇的运动行为。
作者在果蝇的肠道微生物中找到细菌Lactobacillus brevis （短乳杆菌）。给无菌果蝇单一定殖细菌Lactobacillus brevis （短乳杆菌），可使无菌果蝇过度活化行为恢复正常，即恢复到和有菌果蝇一样的运动水平；
其中是L. brevis表达的木糖异构酶起关键作用；木糖异构酶可调节果蝇糖代谢，降低海藻糖水平，从而降低生成神经递质章鱼胺的神经元活性，进而降低果蝇运动行为；
激活该神经元或补充章鱼胺，可消除木糖异构酶对果蝇行为的调节作用。

作者通过三种先前建立的方法测定果蝇的运动行为：果蝇活动监测系统（DAMS，Trikinetics），视频辅助跟踪和步态分析方法。

下面我们来看一下文章的结果：首先看图b运动速度，和图g运动活跃性。正常饲养的肠道有菌果蝇y与无菌果蝇相比较，无菌雌性果蝇增加了移动速度，并且运动行为更加活。进一步观察有菌和无菌果蝇的各项运动行为指标，如：c平均瞬时速度，d平均移动时间，e平均休息时间，f 10min内的运动数。发现无菌果蝇比有菌果蝇运动的瞬时速度更快，平均运动时间更长，休息时间更短。这些数据说明果蝇的肠道物生物可以调控果蝇的行为运动，并且无菌的状态下会使果蝇运动更加活跃。

作者探究是否是特定的细菌会影响果蝇的运动。在实验室饲养的果蝇中，果蝇肠道携带5至20多种不同细菌，L.b短乳杆菌和L.p植物乳杆菌两种细菌是占主导地位的。因此作者选取了L.b短乳杆菌和L.p植物乳杆菌两种细菌分别定殖到无菌果蝇肠道中。A：持续6天用细菌培养物或细菌衍生因子处理无菌果蝇，将细菌定殖到果蝇肠道中。通过观察图b，移动速度，图g，运动活跃性，发现当果蝇单一定殖L.b短乳杆菌时，其移动速度和活跃性就会降低至与正常饲养的有菌果蝇相同的水平（图bg），改变短乳杆菌不同的菌株或宿主的饮食都不会改变短乳杆菌细菌对宿主移动速度的影响（图c,d,e）。

进一步观察了果蝇的瞬时速度，运动时长，休息时长（图cde），短乳杆菌都能够恢复果蝇的运动行为。此外，用短乳杆菌和植物乳杆菌的1：1混合物定殖的无菌果蝇显示出与单独的短乳杆菌相关的果蝇的步行速度的类似变化（h）。说明短乳杆菌都能够影响果蝇的运动行为

探究微生物的影响是否依赖宿主的发育阶段？作者选择在无菌果蝇羽化0天和羽化后3-5天（胃肠道的发育和神经系统的重塑已经完成）单一定殖短乳杆菌（图a），然后观察一系列的运动指标（图bcde），发现0天定殖和3-5天定殖的果蝇运动行为上没有差异。图F中，用广谱抗生素处理常规饲养的果蝇（ABX），表现出与在无菌果蝇相似的运动速度（图f）。同时作者也用两种果蝇野生型进行了重复（图g），用ABX处理的果蝇的运动速度与正常饲养的果蝇是有显著差别的。此外，图i在去除抗生素后，用L.b短乳杆菌而非L.p植物乳杆菌进行定植可将果蝇运动行为降低至与常规饲养的苍蝇相似的水平（图i）。说明：果蝇的运动是受到特定细菌L.b短乳杆菌的调节，并且不依赖宿主的发育阶段介导。

探究短乳杆菌是如何影响果蝇的运动能力?作者将从细菌培养物中收集的上清液（CFS）或热灭活的细菌施用于无菌蝇。说明调控果蝇运动是需要代谢活跃的短乳杆菌的（图a）。图中可看到L.b的CFS上清液有作用，所以猜测是否是L.b菌分泌了某种物质影响了果蝇的运动。相关文献报道，L. brevis 短乳杆菌能够产生尿嘧啶，该物质能够影响宿主的免疫反应，也可能影响宿主运动。单独给无菌果蝇施用具有一定生理作用水平的尿嘧啶，发现没有改变无菌果蝇的运动速度（图f），说明不是尿嘧啶这个物质影响的运动。接下来，作者探究是否是果蝇自身免疫、抗菌肽、摄食行为改变了微生物调节的运动。设计了相关实验，都排除了。
已知（有文献报道）细菌的代谢物中氨基酸和糖类与宿主的行为运动相关，但是细菌代谢酶是否会影响宿主的运动，尚不明确。于是，作者对L.b CFS的进行了生化分析和细菌菌株的比较功能分析（图abcd）图a胰蛋白酶，图b蛋白酶，图c热处理，图d淀粉酶，发现加入胰蛋白酶，蛋白酶和热处理的都与无菌果蝇的运动速度无显著差异，加入淀粉酶的研究有显著差异。确定细菌运动效应是通过特定细菌中存在的蛋白质分子介导的（图abcd）。

大肠杆菌表现出与短乳杆菌相同的作用，可以降低果蝇的运动能力。刚刚已经确定细菌运动效应是通过特定细菌中存在的蛋白质分子介导的，随后，作者筛选出含有与氨基酸和碳水化合物代谢相关的单基因突变的大肠杆菌菌株，发现当突变木糖异构酶的基因时候，加入大肠杆菌的果蝇与无菌果蝇运动无差异，因此，鉴定出xylA木糖异构酶（Xi）作为调节运动行为的候选因子（图f）。Xi催化某些糖的可逆异构化，可将d-葡萄糖转化为d-果糖，并且在测试的细菌菌株中，仅存在于短乳杆菌和大肠杆菌中（图e）。将Xi施用到无菌果蝇中，可以将无菌果蝇的运动恢复到正常水平（图b），图C中的Ai（阿拉伯糖异构酶（Ai *）），这种酶在测试的细菌中也没有差异表达，但是不会影响果蝇的运动速度。此外，作者突变短乳杆菌中产生木糖异构酶的基因，并发现该突变菌株产生的CFS缺乏调节宿主运动速度的能力（图d）。

并且，单独添加Xi的催化产物（d-果糖，d-葡萄糖，d-木糖和d-木酮糖）和用EDTA灭活的Xi处理无菌蝇都不会降低无菌蝇的运动速度（图abc），此时我们可以得出结论，木糖异构酶可以调控果蝇的运动能力。
图e中，对果蝇的碳水化合物分析显示，施用Xi与无菌对照相比，果蝇中核糖（Ribo）水平增加、海藻糖（Treh）水平减少，在果蝇培养基中这些糖是没有差异的（图d）。当利用木糖异构酶处理的果蝇表现出正常行为后，如果仅给予其海藻糖就会恢复期快速运动的模式，这就表明海藻糖或许能够逆转木糖异构酶给果蝇带来的影响(图f)，而核糖则没有（图i）。总之，这些结果表明来自短乳杆菌的Xi可以控制果蝇的运动，其中可能是通过调节关键碳水化合物如海藻糖来调节宿主的运动的。

现在我们知道果蝇肠道微生物L.b通过木糖异构酶调控果蝇的运动速度，并且降低果蝇的运动速度。那么Xi是通过调控果蝇的哪些神经细胞来抑制果蝇运动的呢？换句话说，如果过表达这些神经细胞，就会抵消掉L.b短乳杆菌对无菌果蝇的效应。

于是作者深入研究了果蝇的神经系统，来观察到底哪一种细胞参与了细菌诱导的运动。作者用dTRPA1 （热敏蛋白），通过GAL4-driver体系激活与运动相关的神经元群体基因的表达。图a,正常来说，ABX/L.b CFS是正值并且具有显著差异，但是当章鱼胺的神经元基因（Tdc2,Tβh）表达时，这种激活作用就会抵消短乳杆菌对无菌果蝇的效应，当其他神经元细胞表达时，则不会改变（图a）。Tdc表达细胞的激活，消除了Xi *处理的影响（图b），和消除了常规饲养和抗生素处理的果蝇之间的差异（图c）。同时，用章鱼胺处理常规喂养的，木糖异构酶Xi 处理的或L.b CFS处理的果蝇，果蝇的步行速度增加到与无菌苍蝇类似的水平（图d)。说明章鱼胺这个物质对于果蝇的运动是必要的。

章鱼胺OA和酪胺TA参与宿主生理学的多个方面，包括代谢和行为，并在调节某些运动行为方面具有相反的作用。而施用酪胺不会影响用Xi *处理的无菌蝇的运动速度（图e）。携带Tdc2无效等位基因的用抗生素处理的果蝇，在补充木糖异构酶Xi *时不再表现出运动的差异。携带Tβh无效等位基因的用抗生素处理的果蝇，在补充木糖异构酶Xi *时不再表现出运动的差异，此外，用章鱼胺受体拮抗剂mianserin 米安色林处理补充木糖异构酶Xi *的无菌果蝇时，也不再产生差异。进一步说明章鱼胺对于果蝇的运动调控是必须的。

最终得出结论，果蝇肠道微生物中的短乳杆菌，能够产生木糖异构酶Xi，该酶负调控章鱼胺信号途径，进而抑制果蝇运动。

1、微生物对运动的影响，是性别特异的，有必要进入深入的研究，这篇文章中研究的都是雌性果蝇。
2、有研究表明没有微生物组的小鼠也会表现活跃，小鼠中有一个与章鱼胺类似的,即去甲肾上腺素的物质，值得进一步探究。

Reference

Schretter, C.E., Vielmetter, J., Bartos, I., Marka, Z., Marka, S., Argade, S., and Mazmanian, S.K. (2018). A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature 563, 402-406.

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