2019-06-26 第一天 Dynamic transcriptome profiles within spermatogonial and spermatocyte populations...

title ：Dynamic transcriptome profiles within spermatogonial and spermatocyte populations during postnatal testis maturation revealed by single-cell sequencing

journal ：Plos genetics

IF:5.22

概述：雄性哺乳动物的精子（spermatozoa）最早是由原始生殖细胞（primordial germ cell ，PGC）发育而来，PGC在胚胎6.25天产生，在E10.5天迁移到生殖嵴，13.5天完成性别分化，雄性个体性腺中PGC发育成前精原细胞（prospermatogonia），这是静息状态下的精原细胞的祖细胞，这种状态会一直维持到出生后，出生后的prospermatogonia进入有丝分裂，同时会发生两个不同的发育命运（cell fate），第一个是prospermatogonia直接产生spermatogonia，进入精子发生过程（spermatogenesis），被称为第一波精子发生（first-wave of spermatogenesis），主要是保证雄性个体可以在早期就有产生精子的能力。另一个命运是pro-spg发育产生spermatogonial stem cell（SSC），之后SSC通过自我更新产生新的SSC扩大干细胞储备，同时分化产生各级生精细胞。

本文的作者的团队探究的是这两种细胞命运所产生的同种细胞（spermatogonia和spermatocyte）在转录组水平是否存在差异，即幼年时期的第一波生精过程（first-wave of spermatogenesis）与成年后的生精过程（steady-state）产生的同种细胞是否存在差异

实验过程：

1、样品：来自不同发育时期的小鼠睾丸，使用percoll分选后富集，成年的小鼠睾丸细胞使用精原细胞的marker利用MACS的方法富集，每只小鼠获得4000-5000个细胞

2、测序：10X Genomics Chromium Single Cell 3‘ RNAseq v2 kit 建库，ABI DNA Fragment Analyzer质控，NextSeq平台，150bp读长，文库的平均数据量为98M reads (range 77M-124M)，平均比对率为91%，每个细胞比对的基因为2500-5000个

3、数据分析：使用seurat做数据标准化，非监督的细胞聚类和差异表达分析，批次效应和细胞周期效应通过使用Combat和seurat一起去除，检测到的低于500个基因或者低于2000个UMI或者线粒体基因比例高于15%细胞被剔除，基因表达的raw counts 使用seurat中的NormalizeData，采用的是以尺度因子（scale factor）为10000的全局标准化方法，顺便还做了log2的转化，选择前4000个高变化的基因做PCA ，并选择前30个主成分做了tsne。细胞身份的定位使用的是特定的marker gene，同时使用SingleR 包进行验证，差异分析使用的MAST(Model-based Analysis of Single Cell Transcriptomics),通路的可视化使用的是cytoscape中的enrichmentmap插件

4、ID：GSE121904，https://github.com/nyuhuyang/scRNAseq-SSCs

精子发生中pro-spg的两种命运