Microbiome：扩增子检测环境样本单细胞真核生物和寄生虫的新方法
高通量测序全面检测生物或环境样本的单细胞真核生物和寄生虫
A high-throughput sequencing assay to comprehensively detect and characterize unicellular eukaryotes and helminths from biological and environmental samples
Microbiome, [9.133]
DOI: https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-018-0581-6
第一作者：Matthew V Cannon
通讯作者：David Serre [email protected]
主要单位：马里兰大学，医药学院，基因组科学研究所
其它作者：Haikel Bogale,Lindsay Rutt,Michael Humphrys,Poonum Korpe,Priya Duggal,Jacques Ravel
导读
单细胞真核生物和寄生虫是重要的人类病原体，但缺少方便特异的检测手段；
本文设计多对18S rRNA基因引物，可以检测大多数单细胞真核生物和寄生虫，主要包括顶复门、变形虫、双滴虫、动体目、副基体门、线虫、扁形动物和微孢子虫；
使用NCBI数据库模拟评估扩增产物的长度范围、分辨率等指标适合Illumina测序，自然样品评估结果也覆盖绝大多数目标类群；
本方法是对目前16S扩增子检测手段的有效补充，有助于提供微生物组更全面的认识。
摘要
背景：几次人类严重疾病是由蚊媒或水和食物污染传播的真核寄生虫引起。这些病原体仅为真核单细胞和寄生虫很小比例，环境中有很多末知的生物很微小但对健康有普遍的影响。我们对细菌有很好的分子生物学分析工具，甚至真菌；但对大多细单细胞真核和寄生虫认识很少：检测这些物种通常靠显微镜，无法区分相关物种，分子水平仅能检测特异病原菌。
结果：我们提出一种16S测序类似的高通量测序方法，可以检测大范围的单细胞真核生物和寄生虫，包括所有人类寄生虫的物种分类群。我们设计评估了分类群特异的PCR引物，来扩增8个主要类群(顶复亚门Apicomplexa, 变形虫Amoeba, 双滴虫Diplomonadida, 动体目Kinetoplastida, 副基体门Parabasalia, 线虫Nematoda, 扁形动物Platyhelminthes, 和微孢子Microsporidia)。使用引物筛选临床、生物和环境样本的DNA，测序结果分析表明可鉴定己知和末报导的大多数目标分类。
结论：此高通量分析方法可检测鉴定复杂生物或环境样本中的真核寄生虫和相关物种。本方法容易开展，是对现在方法有效的补充，提供微生物组更全面的视角。
主要结果
表1. 引物的特征和特异性
表1展示了每对引物扩增长度，以及电子评估扩增范围、信息含量和特异性。电子模拟可扩增的物种(NCBI中公开的物种)数量，DNA序列匹配为单独的属或种比例，属于目标类群的比例。最后两栏为引物序列。
图1. 方法流程图
模式图展示扩增、添加标签(barcoding)、混样和测序的流程。
表2. 生物或环境样本中单细胞真核和寄生虫鉴定的示例
每类样本和每类引物，可扩增多达5个物种匹配DNA序列，与NCBI鉴定比例较一致。当一种DNA序列与多个属匹配相等时，结果被标明。详细结果见附表4。
图2. 重建扩增序列与NCBI中序列的进化树
a. 邻接树展示注释的变形虫序列(黑方块)和人类粪便中扩增的序列(绿钻)
b. 邻接树展示注释的双滴虫序列(黑方块)、粪便扩增的序列(绿钻或圆)，和三个波托马可河样本中扩增序列(棕色菱形)。
方法
PCR引物设计
我们设计引物扩增人类寄生虫：顶复亚门Apicomplexa, 变形虫Amoeba, 酵母菌属Blastocystis 双滴虫Diplomonadida, 动体目Kinetoplastida, 副基体门Parabasalia, 线虫Nematoda, 扁形动物Platyhelminthes, 和微孢子Microsporidia。为了我们的目的，引物需满足以下要求：1. 需要扩增目标群体中全部物种，只有很少的非特异扩增；2. 需要鉴定的物种序列有足够的可区分遗传信息；3. 扩增产物应该足够短，可被Illumina测序。
电子评估
基于NCBI公共数据库相关物种，评估引物的物异性，扩增长度，扩增产物有效性等，参考流程https://github.com/MVesuviusC/2018_methods_paper
主要分析过程：
自然样本分析
PCR扩增和高通量测序
生物信息分析
进化分析
总结
本方法可以获得样本中单细胞真核生物和寄生虫的物种信息，是对现有细菌研究的补充，增加我们对微生物组在人类和动物健康的理解。
热心肠日报
新引物扩展 18S rRNA 测序检测范围
原标题：高通量测序全面检测生物或环境样本的单细胞真核生物和寄生虫
① 单细胞真核生物和寄生虫是重要的人类病原体，但缺少方便特异的检测手段；
② 本文设计多对 18S rRNA 基因引物，可以检测多数单细胞真核生物和寄生虫，包括顶复动物、变形虫、酵母、双滴虫、动质虫、线虫、扁形动物和微孢子虫等；
③ 使用NCBI数据库模拟评估扩增产物的长度范围、分辨率等指标适合Illumina测序，自然样品评估结果也覆盖绝大多数目标类群；
④ 本方法是对目前 rRNA 扩增子测序的有效补充，有助于更全面的认识微生物组。
参考文献
新引物扩展 18S rRNA 测序检测范围 https://www.mr-gut.cn/papers/read/1058127404?kf=mobile.search
A high-throughput sequencing assay to comprehensively detect and characterize unicellular eukaryotes and helminths from biological and environmental samples. Microbiome, [9.133] DOI: https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-018-0581-6
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