如何快速评估16S rRNA基因引物的覆盖率及特异性

背景

无论是在进行细菌、古菌高通量测序前,还是细菌、古菌qPCR前,最纠结的问题永远是引物选择评估引物效果最重要的两个指标是覆盖率coverage特异性(specificity。简单讲,覆盖率就是指目标引物能捕获现有数据库中靶序列的比例,比如,共有100种细菌的不同16S rRNA基因序列,某引物能扩增出其中的90种,那么该引物的覆盖率就是90%;特异性是指目标引物是否只靶标某特定类群,比如,某古菌引物PCR获得的序列全部为古菌,没有任何细菌或其他非古菌序列,则其特异性为100%本文将介绍一款超级简单、快速、准确地评估16S rRNA基因引物覆盖率及特异性的工具。

TestPrime 

该工具是SILVA官网发布的一款在线工具,名为TestPrime 1.0,其网址为:https://www.arb-silva.de/search/testprime/,打开网址后其界面如下图1。由图可知,主要包括四部分:Sequence Data,需要将待检测的Forward PrimerReverse Primer序列分别按照5'--3'的方向在此输入;Database,在此选择合适的数据库及比对序列,一般默认为SILVA最新释放版本(目前为r132)的非冗余参考序列(RefNR);Mismatches,可设置所允许的引物最大错配数及3'0错配的长度;Job name,可给当前任务命名。

如何快速评估16S rRNA基因引物的覆盖率及特异性_第1张图片

1. TestPrime 1.0的主界面

使用

将待检测的Forward PrimerReverse Primer序列分别按照5'--3'的方向输入上图“Sequence Data”部分对应文本框中→在“Database”处选择合适的数据库及比对序列→在“Mismatches”处,设置所能允许的引物错配值→在“Job name”处填写此次任务名→点击界面右下角“Run TestPrime”→静待片刻(依网速几分钟十几分钟),收获结果。

运行结束后,可在页面下方的“TestPrime Tasks”看到类似图2所示界面,点击红色箭头处“show result”,即可跳转至相应任务的结果页面。

如何快速评估16S rRNA基因引物的覆盖率及特异性_第2张图片2. TestPrime运行任务列表及进程示例

下拉页面即可看到不同的结果展示内容,主要包括“Overview (all domains)”、“Table of Matched Accessions per Taxonomy”、“Table of Matched Regions”三部分内容(图3)。其中“Table of Matched Accessions per Taxonomy”部分(图3红框标出)就包含引物与SILVA数据库比对后的各分类级别(domaingenus)的覆盖率及特异性等信息。点击左下角“Export Table to CSV”即可导出CSV格式结果数据,用Excel打开文件即可。

 

如何快速评估16S rRNA基因引物的覆盖率及特异性_第3张图片

3. TestPrime运行结果示例

 

示例

现以Walters et al. (2016)文章提到的两对常用细菌&古菌通用引物为例(1),比较新旧引物的覆盖率变化。Walters等在其文章中提到,相比最初的引物515f Original+806r Original,各改变一个碱基后的新引物515f Modified+806r Modified会显著提高对细菌SAR11 clade和古菌Thaumarchaeota的覆盖率这个结论能否通过TestPrime再现呢?

我们分别将两对新旧引物(见表1)通过TestPrime检测其覆盖率,从输出结果中分别将两对引物对总细菌、古菌及所关注的细菌SAR11 clade和古菌Thaumarchaeota的覆盖率整理为2,可发现:新引物对(515fO+806rO)相比旧引物对(515fM+806rM)在0错配(0mis)情况下,虽然对总Bacteria的覆盖率仅由86.8%提高至87.7%,但对细菌SAR11 clade的覆盖率从原来的1.5%显著提高至96.1%!对总Archaea的覆盖率从原来的52.9%显著提高至85.7%,尤其是对古菌Thaumarchaeota从原来0.5%提高至91.8%!因此,通过TestPrime依据SILVA数据库的引物检测结果与Walters等在其文章中提到的结果一致

 

表1. 细菌&古菌通用引物列表

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表2. TestPrime检测细菌&古菌新、旧通用引物结果中摘录的部分类群覆盖率

如何快速评估16S rRNA基因引物的覆盖率及特异性_第5张图片

更多

1. 1Database”处,可选择SSU16S / 18S)或LSU23S / 28S),因此,TestPrime除了量化检测16S rRNA基因引物的覆盖率、特异性等,还可以检测18S23S28S相关的引物对

2. 对于SSU / LSU相关的探针或单引物的覆盖度及特异性检测,可用SILVA开发的另一款在线工具TestProbe 3.0https://www.arb-silva.de/search/testprobe/probe),用法类似,不再赘述。

3. 更详细的教程及更多的引物评估相关参数请参见官网说明:https://www.arb-silva.de/documentation/testprime-tutorial/

4. 引物真实效果与多种因素相关,通过数据库来看覆盖率和特异性只是其中重要一方面,真实效果要合成引物后结合实际实验去验证。

参考文献

Apprill A, McNally S, Parsons R, et al. Minor revision to V4 region SSU rRNA 806R gene primer greatly increases detection of SAR11 bacterioplankton[J]. Aquatic Microbial Ecology, 2015, 75:129-137.

Caporaso J G, Lauber C L, Walters W A, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at adepth of millions of sequences per sample[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 108(Supplement 1): 4516-4522.

Klindworth A, Pruesse E, Schweer T, et al. Evaluation of general 16S ribosomal RNA gene PCR primers for classical and next-generation sequencing-based diversity studies[J].Nucleic Acids Research, 2013, 41(1): e1-e1.

Parada A E, Needham D M, Fuhrman J A. Every base matters: assessing small subunit rRNA primers for marine microbiomes with mock communities, time series and global field samples[J]. Environmental Microbiology, 2016, 18(5): 1403-1414.

Walters W, Hyde E R, Berg-Lyons D, et al. Improved bacterial 16S rRNA gene (V4 and V4-5)and fungal internal transcribed spacer marker gene primers for microbial community surveys[J]. mSystems, 2016, 1(1): e00009-15.

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本期校稿:卢瑟菌 李小圆

本期排版:李小圆

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