【笔记总结】高中生物——【选一 Ⅱ】第二章 微生物的培养与应用

第二章 微生物的培养与应用

一、培养基

定义：根据微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基
基本成分：水，碳源，氮源，无机盐，生长因子，能源（部分物质可同时充当多个成分）
类别：
①固体/液体培养基（凝固剂，常用琼脂），固体培养基还能培养出肉眼可见的菌落（常用）

②通用/选择/鉴别培养基，常用于对照实验中
特殊：乳酸杆菌——添加维生素
霉菌——碱性
细菌——中性或微碱性
厌氧微生物——无氧

二、消毒灭菌

Ⅰ 消毒：杀死微生物和部分芽孢

①煮沸消毒法：100℃，煮沸5~6min，可杀死微生物细胞和部分芽孢
②巴氏消毒法：用于不耐高温的液体，70~75℃煮30min/80℃煮15min，可杀死微生物且营养成分不被破坏
③化学药剂消毒，如酒精，氯气
④物理消毒，如紫外线照射30min

Ⅱ 灭菌：杀死微生物和全部芽孢

①灼烧灭菌：接种环，接种针或其他金属用具，直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧（即外焰），可以迅速彻底的灭菌
②干热灭菌：玻璃器皿和金属用具等，将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160~170℃加热1 ~2h
③高压蒸汽灭菌：先将灭菌物品放置在盛有适量水的高压蒸汽灭菌锅内，将水加热煮沸，冷空气彻底排除后将锅密闭，继续加热使气压上升，一般在压力位100kpa，温度为121℃持续15~30min。
注意：必须等待压力表的压力降到0才能打开排气阀，否则可能1、因为气压差导致冷空气倒灌使器皿破裂2、蒸汽喷出造成伤害

三、牛肉膏蛋白胨固体培养基

制备过程：计算——称量——溶化——灭菌——倒平板
注意事项：
①称取牛肉膏用玻棒挑取——牛肉膏比较黏稠
②称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖——牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮
③溶化时，将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
④在融化过程中，不断用玻棒搅拌使其溶解——防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
⑤配置好后进行高压灭菌+干热灭菌
⑥倒平板注意事项
1、右手拿装培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞
2、右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰（杀菌）
3、用左手将培养皿1打开一条稍大于瓶口的缝隙(不是完全打开)，右手倒入培养基，左手立即盖上皿盖
4、等待平板冷却凝固，将平板倒过来放置——Ⅰ使冷凝水不会从皿盖滴至皿底Ⅱ

四、接种方式

Ⅰ 平板划线法

原理：逐步稀释聚集菌种，直至分离成菌落：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体
注意事项：
1、每次划线前后必须灼烧接种环
2、每次划线要打开一条缝隙，从上一次的末尾开始，划3~5条平行线
3、最后一区的划线不能与第一区相连
4、全过程在酒精灯旁进行

Ⅱ 稀释涂布平板法

原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布道琼脂固体培养基的表面进行培养。
注意事项：全程在火焰旁操作

壹.系列稀释操作
1、将分别盛有9mL 无菌水的六支试管灭菌，然后按10¹~10⁶编号，之后梯度稀释
2、每次将菌液注入试管后，用手指轻压橡皮头，并吹吸三次——使菌液和水充分混匀
3、移液管需要灭菌，操作时试管口和移液管应在离火焰1~2cm处

贰.涂布平板操作
1、每次涂布平板时仅取少量菌液（不超过0.1mL）
2、灭菌涂布器前要取下胶头，灭菌时将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待引燃后冷却8~10s
3、涂布时可转动培养基，使菌液分布均匀

五、菌种保存

①冰箱保藏：4℃，每3~6个月要转移培养基
优点：方便
缺点：保存时间不长，容易污染

②甘油管藏：-20℃冷藏箱，3mL甘油馆+1mL甘油+1mL菌液
优点：保存时间长
缺点：比较麻烦

六、菌种分离

①筛选菌株

1、根据目的菌对生存环境的需求，到相应的环境中去寻找

P.S：细菌在土壤中占比70%_{90%**，在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在**距表层3}8cm的土壤层，因此要铲去表层土
P.P.S：取土样使用的工具都要先进行灭菌，但取土样这一操作不视作无菌操作（常考点）

[2、如果该菌株占比少，先进行选择培养（富集培养）]

3、使用选择培养基进一步培养

②统计菌落数目

采集样品，并用稀释涂布平板法，在适宜温度下培养适宜时间（可计数）

P.S：
细菌：30-37℃，1-2d
放线菌：25-28℃，5-7d
霉菌：25-28℃，3-4d

注意事项：
1、涂布多个平板取平均值
2、一般选择菌落数30~300的平板计数
3、统计菌落数往往<实际数目。原因：多个细胞连在一起时，只观察到一个

③设置对照

目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验可信度
注意：一般需要空白对照，也有随时间变化自成对照的，请仔细分析

七、纤维素酶

①基本概念

纤维素：多糖，葡萄糖组成
纤维素含量较高：棉花，木材，作物
纤维素酶：一种复合酶，至少包括三种组分：C${}_1$酶，C${}_x$酶，葡萄糖苷酶
前两种酶使纤维素分解为纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解为葡萄糖
（全 文 背 诵）

②菌种筛选

主要原理：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与纤维二糖/葡萄糖反应
鉴别方式：观察加入刚果红的培养基是否产生透明圈，透明圈R：内圈菌落R越大，纤维素分解菌效果越好

P.S：在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前可以先选择培养（富集培养）

常考点1：涂布平板时加入刚果红 or 长出菌落后加入刚果红？

第一种：无需洗去浮色，但生成透明圈的菌种可能是分解刚果红的
第二种：一定程度上保证筛选精度，但需要用NaCl溶液洗去浮色

常考点2：纤维素分解菌的选择培养基/鉴别培养基构成

1、选择培养基（液）
纤维素——主要碳源（不是唯一碳源）
酵母膏，水解酪素——生长因子，碳源、氮源
各种盐——无机盐，(调节PH的作用）

2、鉴别培养基（固）
（好像不常考，懒得写了）

常考点3：确定是否为纤维素分解菌
在初步的筛选之后，进行发酵产纤维素酶的实验，可液体/固体发酵
测定方式：对 纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖 进行定量的测定

小结

培养基这一章知识点比较密集，而且比较杂，我谈下个人看法：
1、本章的实验要点非常多，尤其是培养基和培养菌种的方式，建议对这两块单独记忆，而不是照着书一小节一小节的复习
2、考试中反而是选择题最头疼，因为考一些记不太清的细节，实验题反倒还好，因为考察重点会在对照实验上面
3、某些特殊的定义和数字要重视（比如复合酶，30~300）。物质浓度和量相关的数字基本不考，但大字部分的一定牢记。