一、黄酮的分离
从植物向溶剂中转移的过程,主要影响因素是所选溶剂中黄酮类物质的溶解度目前常用的有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙酮等,其中由于甲醇和丙酮等溶剂的毒性较大,而乙醇相对安全且易回收等特点,因此乙醇是目前总黄酮提取中的常用溶剂。基于乙醇为提取溶剂的三叶青总黄酮提取方法主要包括回流法和超声法。其中回流法是最常用且提取效率最高的方法。回流法是指用挥发性有机溶剂浸提三叶青药材成分,浸提液被加热,溶剂馏出后又冷凝回流至药材,这样周而复始,直至有效成分提取完全。包括回流热浸法和回流冷浸法,其中热浸法溶剂用量较多,且在循环时不能更新,而冷浸法的溶剂用量较小,提取时可以循环更新,因此更适合用于三叶青的总黄酮提取。超声法提取黄酮是相对较新的方法,其原理是利用超声波在液体中的空化作用加速黄酮从植物药材中浸出,另外还利用其次效应,如机械振动、扩散和击碎等,加速被提取物的释放。此法具有设备简单、操作方便、提取时间短等优点,对三叶青总黄酮的提取率为555%3另外还包括基于大孔吸附树脂的提取新方法。三叶青黄酮的提取方法中已有陈丹351等人发明的三叶青地上部分总黄酮的提纯方法专利及刘东峰等基于超临界二氧化碳萃取三叶青总黄酮的发明专利,均为三叶青总黄酮的提取技术提供了新的方法学支持。
二、黄酮的测定
目前,测定黄酮类物质的方法很多,主要有分光光度法、色谱法。分光光度法是最常用的三叶青总黄酮含量的测定方法,其中包括直接测定法和显色法直接测定法是在黄酮结构的特征吸收峰波长处测定其含量,对单一成分的样本具有检测方便、快速且准确等优势。但对于复杂的中药成分,由于存在的干扰因素较多,会对测定结果产生影响,出现较大误差。另一种总黄酮含量测定法是在碱性条件下的显色法。主要包含两种显色方式,一种是NaNO2-A1(NO3)3-NaOH比色法,即在测定过程中依次加入NaNO2、A(NO3)3、NaOH溶液,产生稳定的红色化合物在(505±5)m处进行比色测定含量,此法是目前应用最为广泛的测定黄酮类化合物的方法,可以有效地排除多糖和皂苷的干扰。另一种是氯化铝显色法,即在测定的溶液中加入氯化铝溶液,A1+与黄酮类物质的3-或5-羟基与4-羰基,或3',4-邻二酚羟基络合显色,在413mm处有最大吸收色谱技术已经广泛地应用于各种天然产物的定性和定量分析中,常用的色谱技术分为气相色谱和液相色谱两大类。由于黄酮类物质的沸点高,对热不稳定等特征,在进行气相色谱测定前需要对样本进行衍生化处理。因此,在三叶青总黄酮的测定应用中,高效液相色谱法使用较为广泛,也是目前公认的最佳方法。但高效液相色谱存在一定的缺点,主要是价格昂贵,分析时间长,分离效率低等。
