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  凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)可用于(1)研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用;(2)可用于DNA定性和定量分析;(3)用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

  我使用的是thermo的EMSA试剂盒,也用过国产的碧云天的试剂盒。个人觉得二者差异并不大。试剂盒会提供详细的步骤,以下是根据个人实验的经验有所改动,仅供参考。

1.提前配置6%的非变性胶,凝胶时间略微长一点,防止胶凝固不好,影响点样。可以直接合成带Biotin标签的探针,方便使用,无需再给探针加标记。

2.预电泳:冰上,100v,30-60min,在预电泳过程中配置如下表结合反应,加入探针之前先混匀反应液,室温静置10min,加入探针后再静置20min。具体反应根据说明书和自己实验调整。

3. 加入5μl 5×Loding Buffer,轻柔上下吹匀,不可剧烈混匀

4. 电泳:冰上,100V电泳30-40min,溴酚蓝迁移至胶底部2/3或3/4处停止电泳

5. 将尼龙膜剪成与蛋白胶大小相同或稍小,剪角做标记,浸于0.5×TBE,至少10min。

6.  用冷却至4°C的0.5×TBE和干净的海绵,镊子,手套进行转膜

7.  100V,380mA 4°C转膜30-60min

8. 转膜结束后,将膜(带有溴酚蓝的一面)放在干纸巾上1min,使膜表面的缓冲液吸进膜内, 不能使膜变干。紫外交联10分钟左右(可用凝胶成像仪的紫外)。

9. 用15ml 加热至42°C的封闭液Blocking Buffer封闭膜,轻柔摇床孵育15min

10. 将50μl Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate加至16ml Blocking Buffer中,配制Conjugate/ Blocking Buffer。

11. 倒掉封闭液,加入上步的Conjugate/ Blocking Buffer,轻柔摇床孵育15min

12. 将40ml 4×Wash Buffer加至120ml纯水中,配制1×Wash Buffer

13. 将膜移入新平皿内,用20ml 1×Wash Buffer短暂漂洗1min

14. 用20ml 1×Wash Buffer轻柔摇床洗膜3次,每次5min

15. 将膜移入新平皿内,加入30ml 平衡液Substrate Equilibration Buffer,漂洗5min

16. 避光将6ml Luminol/Enhancer Solution加至 6ml Stable Peroxide Solution中,配制成Substrate Working Buffer

17. 将膜取出,用纸巾轻轻接触膜的边缘,吸掉残余的Buffer,移入新平皿内

18. 用Substrate Working Buffer覆盖膜的全部表面,不要摇动,孵育5min

19. 将膜从Substrate Working Buffer提起,用纸巾轻轻接触膜的边缘,吸掉残余的Buffer,但不要使膜变干。

20. 用保鲜膜包住尼龙膜,避免气泡和起皱。

21. 显影并拍照

  个人建议用于EMSA实验的电泳槽及转膜用的东西与western blot的东西分开,避免影响实验结果。

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