作者：华中农业大学植物科学技术学院 陈利珍、赵景
农业发展过程中，虫害一直是影响农业生产、作物产量和品质等的重要因素。长期以来化学杀虫剂一直是控制害虫的主要手段，但化学杀虫剂大量、不合理的使用，带来了诸如农药残留、杀灭天敌等破坏生态平衡、环境污染的严重问题。同时化学杀虫剂也会危及人类健康，人们长期接触杀虫剂，会引起头晕目眩、恶心、倦怠、抑郁等症状，严重者甚至中毒死亡。生物技术的迅猛发展推动着农业实践的变化，生物杀虫剂得以出现并被广泛应用。由于生物杀虫剂的环境友好性与安全性，其已成为绿色种植业的最佳选择。生物杀虫剂传统使用方式是以农药形式喷洒，但由于存在容易在环境中分解，需要在害虫特定时期喷洒等缺点使其难以大量推广应用。
利用转基因生物技术将传统生物杀虫剂的抗虫基因转入作物中表达，使得作物能在整个生长季持续抵抗特定的重要害虫成为现实，具有传统方式无法比拟的优势，因此自1996年以来，转基因抗虫作物的研发及应用获得了极大发展，2016年转基因抗虫作物和含抗虫性状的复合转基因作物种植面积接近9000万公顷，占全球转基因作物种植面积的50%左右[1]。尽管转基因抗虫作物的大量种植在减少化学杀虫剂使用、保护生物多样性，提高作物产量等方面带来了巨大效益，但转基因抗虫作物的安全性问题一直是舆论的热点话题，一些不明真相的人们总是提出“虫吃了会死，人吃了会没事？”的质疑，甚至传播转基因抗虫作物中主要表达的Cry杀虫蛋白危害人类健康的歪曲负面报道，Cry蛋白一直处于舆论的风口浪尖。但事实本身是，Cry蛋白是“虫吃了会死，人吃了就是没事！”，以下让我们通过Cry 蛋白的前世今生介绍来认识这类转基因抗虫作物表达的主要蛋白吧！
目前转基因抗虫作物中应用的抗虫基因有很多种，其中苏云金芽孢杆菌表达的Cry抗虫基因应用最为广泛。表达Cry蛋白的母体细菌苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，以下简称Bt），是一种广泛分布在土壤、植物根际和叶面、及昆虫、环节动物和食虫哺乳动物体内中的一种革兰氏阳性细菌，1911年由Berliner从德国苏云金省染病的地中海粉螟幼虫中分离出并命名。如图1所示，Bt细菌在自然界中主要存在三种形式，红色矩形的营养体，以及在特定条件下形成的芽孢（休眠体，黄椭圆形）和伴随芽孢形成的伴孢晶体（粉红色菱形）[2]。随后的研究发现，当某些鳞翅目幼虫取食Bt的芽孢和伴孢晶体后，停止取食和死亡，于是于1938年首次在欧洲开发出商业化应用的Bt生物杀虫剂。进一步研究发现，Bt能够杀死鳞翅目幼虫等昆虫的主要机理主要为其伴孢晶体中含有20%左右的Cry蛋白（Bt crystal（cry） proteins）、Cyt蛋白、White蛋白等杀虫蛋白，另外在其营养体中也发现一类营养体杀虫蛋白（Vegetative insecticidal proteins，Vips，转基因抗虫植物表达的另一种抗虫蛋白，本文不具体介绍）。在Bt的众多杀虫蛋白中，Cry蛋白可控性大，只对靶标害虫有效，而对其他生物无任何活性，又因为其是Bt的主要杀虫活性成分，所以目前转Bt基因作物大多都是利用转Cry蛋白基因以实现抗虫效果。
Cry蛋白是包含几百个成员的一大类蛋白家族。早期，因为发现的Cry基因数目不大，分类较为简单，按照氨基酸序列和杀虫谱的不同分为了四个群，即CryⅠ（抗鳞翅目昆虫）、CryⅡ（抗鳞翅目与双翅目昆虫）、CryⅢ（抗鞘翅目昆虫）和CryⅣ（抗双翅目昆虫）。而随着自然界中众多Bt菌株中新Cry基因的发现，传统分类体系已难以统一，新的分类方法出现，即根据氨基酸同源性进行分级分类，并建立Bt蛋白命名数据库。截止到2014年，按照新的分类方法，科学研究已发现74群768种Cry蛋白[3]。科学家们针对常见的Cry蛋白做了大量杀虫谱试验，发现不同Cry蛋白具有自己特异的杀虫谱，如转基因抗虫作物常用的Cry1Ac蛋白仅杀死部分鳞翅目昆虫幼虫，Cry2Ab仅杀死部分鳞翅目及双翅目昆虫，即不同Cry蛋白具有各自的特异杀虫谱。此外，Cry蛋白对害虫的毒力高低也并非绝对固定，不同国家和地区的同种害虫对同一Cry蛋白的敏感性是存在差异的，这可能是因为长时间的地理隔离，导致害虫在生物进化过程中产生生理差别，使得同一害虫在不同地域表现出不同的适应性。
那么 Cry蛋白到底是如何特异性杀死靶标害虫的呢？早期研究发现，无论是靶标害虫直接接触到产生Cry蛋白的Bt伴孢晶体，还是直接注射Bt伴孢晶体到昆虫血腔中，均对靶标害虫无致死效果，只有靶标昆虫取食Bt伴孢晶体或纯Cry蛋白后才能死亡，即Cry蛋白在靶标害虫肠道的“特定环境”中才能起到对靶标害虫的毒杀作用。Cry蛋白如何在靶标昆虫的肠道“特定环境”中起作用呢？经研究证实，Cry蛋白被靶标昆虫取食后，首先在靶标昆虫肠道所具有的特殊强碱性环境溶解，然后被靶标昆虫中特异的消化酶切除部分氨基酸序列变成活化形式的蛋白，然后活化Cry蛋白与靶标昆虫肠道上皮细胞上的特定受体蛋白结合后破坏肠道细胞而引起靶标昆虫败血症死亡[4]。通过对大量的昆虫研究发现，不同Cry蛋白的杀虫特异性主要与不同昆虫中肠细胞上受体的不同有关，即每种昆虫均有自己特异的Cry蛋白结合受体谱。
经常有反对转基因抗虫作物的人利用“虫吃了会死，人吃了会没事？”这句话混淆公众对转基因抗虫作物安全性的认识，他们试图通过Cry蛋白能够“杀死”某些昆虫的事实来论证Cry蛋白对人体有害。但其实这一句常被反对者们挂在嘴边的话并不成立。从Cry蛋白的杀虫原理可以看出，Cry蛋白能够杀死昆虫三个必备条件靶标昆虫的中肠碱性环境、Cry蛋白在靶标昆虫中的特异活化和活化Cry蛋白与中肠受体的特异结合缺一不可，但人类等哺乳动物中分泌的胃液呈强酸性，消化系统中也不会特异性活化Cry蛋白，同时也不存在能够与Cry蛋白结合的特异受体。因此，Cry蛋白被哺乳动物摄入后，与普通蛋白质一样，命运是被消化成氨基酸或被排出体外，并不会对人类健康产生影响。另外，从图1可以看出，成千上万年来含有Cry蛋白的Bt在自然界中广泛存在，如果人吃了有事那将是多恐惧的事情。因此，“虫吃了会死，人吃了就是没事！”就是这么简单！
既然虫吃了会死，人吃了没事，那我们就不用管Cry蛋白的安全性了吗？事实是，科学家和相关部门对Cry蛋白的安全性进行了大量安全性评价工作。目前Cry蛋白的安全性评价研究工作主要包括：一是对人类健康影响的评估。一方面，大量对转Cry基因抗虫植物各部分中Cry蛋白表达含量分析的公开报道表明：商品化转Cry基因作物中Cry蛋白在可食用部位含量较低，不足以引发毒性或疾病；另一方面，迄今所测定的Cry蛋白与已知的蛋白质食品过敏原没有相似的氨基酸序列，即Cry蛋白不存在潜在致敏风险。通过对Bt制剂和特定转Cry基因作物的研究，在实验室和田间阶段已经确定了Cry蛋白对人体的安全性。二是对非靶标生物影响的评价：第一非靶标哺乳动物，超过100篇的公开学术论文对啮齿动物等的研究证明Cry蛋白对非靶标哺乳动物不可能产生毒性；第二鸟类，已发表的Cry蛋白对鸟类急性口服毒性实验研究结果表明Cry蛋白对非靶标鸟类无毒或不致病；第三淡水鱼类，对大鳍鳞鳃太阳鱼、虹鳟鱼或鲶鱼等的测验中未见Cry蛋白引发的不良反应；第四淡水中无脊椎动物，Cry蛋白在植物中的表达对淡水中无脊椎动物无毒性或不致病；第五蚯蚓，已发表的研究证明商品化的转Cry基因作物表达的Cry蛋白未对蚯蚓产生不良反应；第六非靶标昆虫，已经公开报道的近千个对可能受毒素影响的昆虫进行的广泛测试研究表明，Cry蛋白对非靶标昆虫一般没有毒性，但与靶标害虫亲缘相近的昆虫幼虫可能受影响。迄今为止，已进行的田间测试结果表明Cry蛋白对非靶标生物不会产生非预期影响。
Cry蛋白资源丰富，但并不是每一种Cry蛋白都适合转入到转基因作物中用于杀虫。当前在国际上已获审批的转基因抗虫作物产生的Cry蛋白种类包括Cry1Ab、Cry1F、Cry1A.105、Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3Bb、Cry34Ab1和Cry35Ab1等。而这些转Cry基因抗虫作物的种植，均是种植转Cry基因抗虫作物的国家根据转基因安全评价管理中的个案评价原则而一一获得大量对多种生物及环境的安全性评价数据后证明无负面影响的前提下才批准的。因此，运用少的未经安全评价的Cry蛋白仍需要科学家们加大研究力度，为未来更多种类Cry蛋白安全性评价储备大量的科学依据。我国Cry蛋白研究发展迅速，相关领域研究已处于国际前沿，目前一批明确杀虫功能的Cry基因已经获得专利保护。在未来的研究中，相信更多的Cry蛋白基因将被开发出来，Cry蛋白的抗虫谱将逐渐被完善。随着Cry蛋白的深入研究和在转基因抗虫作物中的有效应用，将为害虫防治、降低农药残留以及减轻由农药残留带来的环境问题提供一种有效的解决途径。
参考文献：
[1] ISAAA. 2016. Global Status of CommercializedBiotech/GM Crops: 2016. ISAAA Brief No. 52. ISAAA: Ithaca, NY.
[2] Raymond, B., Johnston, P.R., Nielsen-LeRoux,C., Lereclus, D., and Crickmore, N. (2010). Bacillus thuringiensis: an impotentpathogen? Trends in microbiology 18, 189-194.
[3] Crickmore, N., Zeigler, D.R., Schnepf, E., VanRie, J., Lereclus, D., Baum, J., Bravo, A., Dean, D.H., 2014. Bacillusthuringiensis toxin nomenclature. http://www.biols. susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html.
[4] Bravo, A., Likitvivatanavong, S., Gill, S.S.,and Soberon, M. (2011). Bacillus thuringiensis: A story of a successfulbioinsecticide. Insect biochemistry and molecular biology 41, 423-431.