作者：biofan
审稿：童蒙
编辑：amethyst/angelica
引言
随着科技发展，肿瘤的治疗也取得了显著的进展。然而由于肿瘤异质性的存在，导致靶向治疗或者免疫疗法上存在着许多难题。最近热门的ecDNA也许为解释肿瘤的异质性打开了一扇新的大门，对未来肿瘤检测和治疗都有深远的意义。
2019年末两篇关于ecDNA的大作背靠背发表，在朋友圈一阵狂风大作、满屏皆是。惊觉肿瘤细胞还有这样的神操作，感觉进入了一个崭新的世界，又惊又喜。于是一顿恶补，发现在2018年的《Nature Genetics》（ IF：25.45）还有一篇相关的经典文章，题为《Discordant inheritance of chromosomal and extrachromosomal DNA elements contributes to dynamic disease evolution in glioblastoma》。
在这里和大家看一下这篇文章的内容，给大家分享一下研究思路，说不定下个发NG的就是你！
研究背景
ecDNA 是一系列能够编码原癌基因的小片段环状DNA，它们在肿瘤细胞中非常常见，而在正常的细胞中几乎没有，这可能是导致肿瘤异质性的根本性原因。
肿瘤异质性是恶性肿瘤的特征之一，是指肿瘤在生长过程中，经过多次分裂增殖，其子细胞呈现出分子生物学或基因方面的改变，从而使肿瘤的生长速度、侵袭能力、对药物的敏感性、预后等各方面产生差异。
整体思路
肿瘤异质性也被认为是癌症治愈的“拦路虎”。以恶性胶质瘤（glioblastoma，GBM）为例，是其中最常见且最具攻击性的脑癌，常规治疗疗效不良，两年生存率仅为15%。为了探寻GBM异质性的原因，杰克逊实验室（Jackson Laboratory，JAX）专门对患者治疗前后以及异种移植（PDX）小鼠模型肿瘤细胞进化过程中的基因组变化进行了研究。
作者利用全基因组测序、高深度全外显子测序和三代长读长测序，分析ecDNA和肿瘤克隆进化的相关特征，对肿瘤异质性的潜在原因进行了多方面研究，并用FISH实验进行验证。
整体实验方案如下图，相关涉及软件我们也进行了贴心标注。
材料和方法
本文选取了12个新鉴定为胶质瘤和1个复发的胶质瘤样本，样本信息如下，其中HF3177为复发的胶质瘤样本。
作者从胶质瘤样本提取神经球细胞，培养并移植到小鼠体内构建颅内肿瘤模型（PDX），每个样本构建3个重复，如下图。
结果展示
1.全基因组基因拷贝数突变图谱构建
对胶质瘤原癌组织、原癌细胞（提取胶质瘤神经球细胞进行培养）以及颅内肿瘤移植模型（PDX）进行低深度的全基因组测序（6.5X）后，构建全基因组分子变异特征谱（如下图）。研究发现组织水平、细胞层面以及移植模型均在拷贝数扩增上有着很大的异质性，例如MYC基因在原癌组织中并未检测到扩增，然而在PDX却发现有大量的扩增。
2.胶质瘤中存在大量的ecDNA
1. 使用AmpliconArchitect检测ecDNA
基于全基因组测序结果，作者利用AmpliconArchitect（Deshpande, V., et al.,）算法（专门用于寻找基因组来源的ecDNA，主要原理是基于全基因组测序的数据比对结果，自动检索基因组断裂点和其他基因组扩增子的区域，结合CNV和SV的结果，形成ecDNA完整序列的报告）共鉴定出了74个来源于21个基因位点的ecDNAs（如下图）。
2. 使用FISH对ecDNA进行验证
随后作者设计了探针，通过FISH荧光杂交对这些ecDNA进行了验证。发现这些ecDNA在同种样本的不同层面（原癌组织，原癌细胞，移植模型）均有很大的异质性，并且在颅内移植模型有大量增多的现象（如下图B）。
3.异质性研究
1.MET_ecDNA标记不同细胞亚群
MET也称c-Met或肝细胞生L因子（Hepatocyte Growth Factor，HFG）受体，是一种酪氨酸激酶（Tyrosine kinase）。MET一般在上皮细胞组织表达。MET的激活机制有多种，比如过度表达、基因扩增、基因变异、自源性或旁源性的HGF激活等。有肿瘤遗传学证据表明MET的变异可以致癌，且多见于多发性髓样瘤和脑胶质瘤。
MET抑制剂作为抗癌药的开发也有很多挑战，如果MET激活是由基因扩增造成，抑制MET蛋白可能进一步激活其基因的表达，产生更多的MET。“真是野火扑不尽，随风吹又生”。针对MET基因的研究，作者着重研究了样本HF3035两个不同的时期（p5，p7），对于样本HF3077取了同一时期（p11）进行了研究，通过荧光原位杂交FISH发现MET不仅在同一样本不同时期差异很大，而且在同一样本同一时期不同细胞也有很大的差异（如下图A）。
2. 使用全外显子测序推断亚克隆结构
针对全外显子测序（～1400X）数据，作者使用PyClone来推断肿瘤纯度及肿瘤内部亚克隆结构，发现不管是不同时期还是同一时期原癌组织，原癌细胞以及移植模型都有着很大的异质性（如下图C）。
3.通过CNV预测MET-Capza2可能形成环状结构
通过拷贝数变异发现，MET的拷贝越过间区横跨到Capza2（如下图B），暗示MET-Capza2可能形成环状结构。
4.使用三代数据对ecDNA进行分析
随后文章作者通过三代测序对上述“MET-Capza2可能形成环状结构”的猜测进行了验证。
针对三代的数据，作者通过Canu（Berlin K, et al.）进行了从头组装，并将组装好的contig利用nucmer（Delcher AL, et al.）比对到人的参考基因组上，对融合的contig进行筛选（two contigs were considered to be connected only if they shared a sequence fragment which was at least 5,000 bp long with the minimum 99% identity）发现3个contig都比对到了MET，Capza2区域，并且3个contig之间的overlap超过了5k（如下图），从而进一步证实MET-Capza2的环状结构。
5.多个ecDNA元件在患者GBM及其移植模型系统中纵向保留
相对于原发的样本，复发样本的Myc_ecDNA比例显著增多（下图C），同时Myc周围共扩增的区域发生了变化，部分区域纵向保留（如下图D，相同样本的原癌组织，原癌细胞以及移植模型有相同的扩增）。
原癌基因EGFR和CDK4则发生了共拷贝（下图B）现象，暗示它们可能处于同一个ecDNA环，而进一步的荧光原位杂交FISH通过共定位则证实了这一结论（下图F），从而揭示了ecDNA不仅仅有单个驱动基因组成，也有可能由多个驱动基因组成。
结论
近年来多篇文献证实癌基因存在于 ecDNA，这无疑给癌症治疗领域带来了崭新的希望。ecDNA可变剪接的异质性，ecDNA扩增的异质性以及ecDNA随机分配的异质性深入地揭示了癌症异质性、耐药性的本质。
然而，关于ecDNA的研究目前还有很多重要的科学问题没有得到很好的解答，例如ecDNA到底是如何形成的？是否存在ecDNA的拼接热点？ecDNA对基因组DNA有何影响，能否结合液相分离来探寻其在细胞间的传递机制？随着技术的进步，我们也会逐渐找到答案。
参考文献
- Ana C. deCarvalho1,et al.Discordant inheritance of chromosomal and extrachromosomal DNA elements contributes to dynamic disease evolution in glioblastoma
- Deshpande, V., et al., Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun, 2019. 10(1): p. 392
- Berlin K, et al. Assembling large genomes with single-molecule sequencing and locality-sensitive hashing. Nat Biotechnol. 2015; 33:623–30.
- Delcher AL, et al. Alignment of whole genomes. Nucleic Acids Res. 1999; 27:2369–76.
作者|biofan
审稿|童蒙
编辑|amethyst/angelica