Read count CPM RPKM

RNA-seq看表达量高低是看哪个值？
1.Read count
(1)数值概念：比对到gene A的reads数。
(2)用途：用于换算CPM、RPKM等后续其他指标；作为基因表达差异分析的输入数值。
大部分差异分析软件（如DESeq和edgeR），用原始的可比对的reads count作为输入，并用负二项分布模型估算样本间基因差异表达的概率。

软件自动会对reads count做一些校正。如果你使用一些校正后的指标，例如RPKM作为输入，是不合理的。

2.CPM：Counts per million
(1)数值概念：计算公式：CPM=C/N*1000000
设C为比对到 gene A 的 reads 数（read count），
N 为比对到所有 gene 的总reads 数。

(2)用途：在某些情况下,只想了解每个基因被覆盖到的相对reads数，而不希望对其做长度校正，就会使用这个指标。

在某些RNA-seq文章或一些软件输出结果中（如edgeR）会出现。
CPM只对read count相对总reads数做了数量的均一化。

当如果想进行表达量的基因间比较，则不得不考虑基因长度的不同。

如果进一步做长度的均一化，就得到了下面的RPKM。

3.RPKM：Reads Per kb perMillion reads
(1)数值概念：计算公式：RPKM=(1000000C)/(NL/1000)
设C 为比对到 gene A 的 reads数（read count），
N为比对到所有 gene 的总 reads 数，L 为 gene A 的碱基数。 RPKM法能消除基因长度和测序量差异对计算基因表达的影响，
计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异。

(2)用途：用于与基因表达量相关的后期分析.例如:基因表达趋势分析,共表达网络构建，热图绘制等都使用这类数值。

FPKM意义与RPKM极为相近。
二者区别仅在于，Fragment 与Read。

RPKM的诞生是针对早期的SE测序，FPKM则是在PE测序上对RPKM的校正。

只要明确Reads和Fragments的区别，RPKM和FPKM的概念便易于区分。
Reads即是指下机后fastq数据中的每一条Reads，
Fragments则是指每一段用于测序的核酸片段。

1.RNA-Seq又称转录组高通量测序(transcriptome sequencing)或称为全转录组鸟枪法测序(Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS)

把高通量测序技术应用到由 RNA 逆转录生成的 cDNA 上，

从而获得来自不同基因的RNA 片段在特定样本中的含量

2.基因表达（gene expression）
基因组中结构基因经过转录、翻译等过程，合成蛋白质，
进而发挥其特定的生物学功能的全过程。

3.转录组
遗传学中心法则表明,遗传信息通过信使RNA(mRNA)从DNA传递到蛋白质,
因此,mRNA被称为DNA和蛋白质之间信息传递的”桥梁”,

而所有表达基因的序列及其转录水平,综合起来被称为 转录组(transcriptome)。
即:特定组织或细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，
包括mRNA和非编码RNA。

转录组（transcriptome）
广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，
包括信使mRNA、核糖体rRNA、转运tRNA及非编码non-coding RNA；
狭义上指所有mRNA的集合。

蛋白质是行使细胞功能的主要承担者，蛋白质组是细胞功能和状态的最直接描述，

转录组成为研究基因表达的主要手段，
转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的蛋白质组的必然纽带，
转录水平的调控是目前研究最多的，也是生物体最重要的调控方式。

基因的Transcript Variant 和 isoform的区别如下：
1.transcript variant是从结果来看的，一个基因产生了不同的mRNA；
splice variant是从过程讲的，强调内含子剪切的方式不一样。
variant指的是转录本的亚型，
isform指的是蛋白水平的。
有的时候虽然variant很多但是对应的蛋白可能是重复的。

2.有很多过程可以影响isoform的形成，如可变剪切，
即不一定所有的外显子都用来形成成熟的mRNA,而且有时候什么内含子,外显子也不是绝对的。

另外有RNA editing这个过程，会使得形成mRNA时某个特定的位置的碱基发生变化，
也就是变成不是原来基因想要编码的东西。

有个例子就是一个叫XBP-1的转录因子，它调控细胞的unfolded protein response，

激活方式就是上游蛋白剪切其mRNA然后生成有活性的mRNA，
所以这种variant的生成竟然也是调控的一种方法。