笔记内容：
- 热图的应用意义
- 包的安装
- scale的作用
- 作图细节：系统发生树，label, color key的问题等
- 补充：添加多行ColSideColors
- 补充：heatmap.3示例
- 补充：ComplexHeatmap::Heatmap
热图的应用意义
在paper中常常能看到热图（heatmap）：“形式为功能服务”。在我们常见的，使用矩阵作为Input的二维热图中，多为基因表达差异，16s分析中不同分组的物种丰度/相对丰度差异提供线索及可视化效果。
使用热图可以直观通过颜色的深浅和差异判断样本/组别之间的差异。结合统计检验的显著性结果，可以评估出显著性的方向。热图可以通过算法生成系统树，表现各个subject及feature的聚类关系。
在R中可以使用gplots包中的heatmap.2轻松画出热图。但对于其scale, 系统树的建立，以及很细节的字体大小，图片大小，color key的数值范围设置，对应的颜色设置等，均需要通过参数的调整实现。虽然比起其他编程工具，R是个封装很严实的软件，这意味着许多参数不能很灵活的去修改。但这不妨碍我们充分使用它带来的便利。
包的安装
install.packages("gplots")
install.packages("RColorBrewer")
install.packages("devtools")
library(devtools)
install.github("stanstrup/massageR")
安装massageR包是为了对热图的input矩阵做一些处理，这个包的安装有些曲折，在win10系统上按照以下两步先安装devtools再通过github装massageR没问题，但是在linux系统上不能在R sutdio里直接这么安装，详见 R使用笔记第11条
在本笔记中不使用massageR包也可以，heatmap.2可以搞定。
scale的作用
plot_color = c('orange','green')[treatment]
# treatment为meta data中提取出的分组信息，必须为一个factor
# 如果在input data中把sampleID整理为分组的顺序，那么会在colsidecolors这里显示为整齐的分为两组。
heatmap.2(x, #Input必须是matrix
trace="none", # trace可以给每个色块中添加一条线，与行平行或者与列平行。其与色块中心的距离代表了这个值被显示的比例。
scale="none", # scale在这里
ColSideColors = plot_color, # 按照treatment组别给每个subject一个颜色
dendrogram = "row", # 生成row的系统发生树
symbreaks = TRUE,
col=rev(colorRampPalette(brewer.pal(10, "RdBu"))(20)), # color key, 后面详叙
breaks = seq(-0.5,0.5,0.05), # 还是color key
density.info=c("none"), # 还是color key
margins=c(8,16), # 调整热图大小比例
cexRow = 0.8, cexCol = 1.0, # 行列名字体大小
srtCol = 45, offsetCol = -0.5 # 调整列名的字体倾斜45度，距离热图的距离缩小。
)
会出现这样的图。很丑，看不出规律。这是因为我们input的矩阵还没有经过标准化（normalized/scaling）。许多值集中在一个很小的范围，突然出现几个很大的值，大得不成比例。导致这种情况：为了照顾那几个极端值，大部分值之间的差异被掩盖掉了，所以留下大片几乎一样的颜色。标准化即经过一定比例控制，将数据的规律保留，并将数值标化在一个相对稳定的范围内，更加便于作图。
但是如果把scale的参数调整为scale="row"
scale = "row" 即针对行进行标化，
作图细节：系统发生树，label，color key的问题等
heatmap.2(x,
trace="none",
scale="none", # scale在这里
ColSideColors = plot_color, # 按照treatment组别给每个subject一个颜色
Rowv = TRUE, # 决定是否要将row按照系统发生树cluster的结果重新排序，注意要和dendrogram一致。同理还有Colv =
dendrogram = "row", # 生成row的系统发生树
symbreaks = TRUE,
col=rev(colorRampPalette(brewer.pal(10, "RdBu"))(20)),
# color key在左上角，本图中为row-scale过，所以为row Z-score
# 设置color key的颜色，这里为20个色块构成，从蓝色到红色
breaks = seq(-0.5,0.5,0.05),
# 设置color key的范围，这里必须和上面col = 的20个色块对应起来。
# 从-0.5到0.5，以0.05为一个step,一共20个step, 对应20个色块。
density.info=c("none"),
# 设置color key中是否需要显示各个范围的count数目及其比例。none就不设置。
margins=c(8,16),
# 调整热图大小比例，在label的名字特别长的时候可以尝试调整，让Label显示完全
cexRow = 0.8, cexCol = 0.8， # 行/列名字体大小
keysize = 0.8 # 可以配合margins = 调节图例的大小及整个图的比例
colsep = c(15, 54)
#在热图中加入白色竖线，从而将其分成不同的部分。这个表示在第15个及第54个column的位置加上竖线。同理还有rowsep =
)
如果想把生成系统发生树聚类后的数据拿出来（即获得聚类后重新排列后的数据）：
map <- heatmap.2(as.matrix(x), ...)
x_reorder <- x[rev(map$rowInd), map$colInd]
# x_reorder 为重新排序后的数据
heatmap.2的文件非常详细，见这个链接
添加多行ColSideColors
需要用到heatmap.plus包，其各种参数和heatmap.2差不多，但是heatmap.2只能为ColSideColors设置与column长度相当的character, heatmap.plus可以设置为matrix: 其实只用把两个（或者多个）含有颜色分配信息的vectorcbind到一起就可以了。
调整参数为ColSideColors = color # 注意使用heatmap.plus
另外有个升级版heatmap.3，参数基于heatmap.2，同样可以添加多行ColSideColors:
#通过devtools把heatmap.3的代码导入本地：
library(devtools)
source_url("https://raw.githubusercontent.com/obigriffith/biostar-tutorials/master/Heatmaps/heatmap.3.R")
heatmap.3(...)
### 2019.7.9 notes: 这个好像不是GMD包里的heatmap.3...???但是仍然可以用...???
# 以下是GMD包里的heatmap.3，注意和上面的不一样！！！
# 安装：
# （建议最好还是用上面那个heatmap.3，下面那篇帖子很全，GMD没有多少demo，color也不知道怎么设置=_=）
packageurl <- "https://cran.r-project.org/src/contrib/Archive/GMD/GMD_0.3.3.tar.gz"
install.packages(packageurl, repos=NULL, type="source")
library(GMD)
heatmap.3(...)
参考这篇BioStars上的帖子
参考heatmap.3的文档
heatmap.3示例
library(devtools)
source_url("https://raw.githubusercontent.com/obigriffith/biostar-tutorials/master/Heatmaps/heatmap.3.R")
install.packages("mlbench") # 只是用里面的示例数据Glass
library(mlbench)
data(Glass)
# Glass如下所示
RI Na Mg Al Si K Ca Ba Fe Type
1 1.52101 13.64 4.49 1.10 71.78 0.06 8.75 0.00 0.00 1
2 1.51761 13.89 3.60 1.36 72.73 0.48 7.83 0.00 0.00 1
3 1.51618 13.53 3.55 1.54 72.99 0.39 7.78 0.00 0.00 1
4 1.51766 13.21 3.69 1.29 72.61 0.57 8.22 0.00 0.00 1
5 1.51742 13.27 3.62 1.24 73.08 0.55 8.07 0.00 0.00 1
Glass$fake_gp = c(rep('g1',107),rep('g2',107)) # 加一个fake_gp的分组
Glass$fake_gp = factor(Glass$fake_gp,levels = c('g1','g2'))
# 注意一定要转成factor
color_matrix = cbind(brewer.pal(7,"Set1")[Glass$Type],
c('black','grey50')[Glass$fake_gp])
colnames(color_matrix) = c('Type','fake_gp')
# 给color_matrix加上colname, 会当作colorbar名称在图中显示
df = Glass[1:9]
heatmap.3(df,
scale="col",
dendrogram = "row",
distfun = function(x){as.dist(1-cor(t(x)))}, # 不设置的话会用默认的
hclustfun = function(x){hclust(x, method = 'average')}, # 不设置的话会用默认的
Rowv = TRUE, Colv = FALSE,
symbreaks = FALSE,
col=rev(brewer.pal(10, "RdBu")),
RowSideColors = t(color_matrix), # 注意用t()转换，因为这里是rowside, colside则不用
breaks = seq(-1,1,0.2),
density.info=c("none"),
margins=c(10,10), # 设置热图横纵两个方向的留白
cexRow = 1, cexCol = 1,
# colsep = c(24,48,72),
# sepwidth = c(0.2,0.2), # 如果需要热图从中间分开，则设置这两个参数
keysize = 0.8,
key = TRUE,
symkey = FALSE
# KeyValueName = ... # 设置这个参数则替换“Column Z-Score”文本
)
这个post很有参考价值，包括了
symkey调整color的用途，不同包默认的建树设置等。
ComplexHeatmap::Heatmap
ComplexHeatmap是一个bioconductor的包，需要这样安装：参考
BiocManager::install("ComplexHeatmap")
官方的Documentation, 是非常详细的使用指南:https://jokergoo.github.io/ComplexHeatmap-reference/book/introduction.html
优点在于自动附上了图例；可以添加多个row或者column的annotation；在annotation是连续型变量是不用手动设置intervel。可以把heatmap.2中构建的树完整移植过来。
一个示例，使用瞎掰的数据集mat
library(ComplexHeatmap)
library(circlize)
library(dendextend)
library(RColorBrewer)
# 瞎掰数据集mat
set.seed(123)
mat = matrix(rnorm(100),10)
rownames(mat) = paste0("R",1:10)
colnames(mat) = paste0("c",1:10)
# 再掰一个meta data,用于做heatmap的annotation
meta_mat = data.frame(ind=1:10)
meta_mat$m1 = c(rep('a',5),rep('b',5))
meta_mat$m2 = c(rep('c',2),rep('d',3),rep('e',5))
meta_mat$m3 = rnorm(10)
数据集一览：
mat
meta_mat
# 给heatmap的行做annotation, 注意对应每个变量，指定颜色
row_ha = rowAnnotation(df=meta_mat[,c('m1','m2','m3')],
col=list(m1=c('a' = 'blue','b'='red'),
m2=c('c'='pink','d'='darkgreen','e'='grey50'),
m3=circlize::colorRamp2(c(-1,0,1), c("blue", "white", "red"))))
ComplexHeatmap::Heatmap(mat,name='mat',
column_title = 'test_mat',
right_annotation = row_ha,
col = rev(brewer.pal(10,"RdBu")), # 热图的颜色
column_dend_height = unit(3,"cm"), # 设置树的大小
# 这里设置了一个对聚类树的分割及上色，在h=2.5处分簇并着色：
cluster_columns = dendextend::color_branches(as.dendrogram(hclust(dist(mat))),
h = 2.5),
show_column_names = F # 不显示column name
)
如果用heatmap.3来做：
meta_mat$m1 = factor(meta_mat$m1,levels = c('a','b'))
meta_mat$m2 = factor(meta_mat$m2,levels = c('c','d','e'))
# 设置intervel
meta_mat$inter = findInterval(meta_mat$m3,
sort(meta_mat$m3,decreasing = F))
pal = colorRampPalette(c('white','red'))
color_matrix = data.frame(
m1=c('blue','red')[meta_mat$m1],
m2=c('pink','darkgreen','grey50')[meta_mat$m2],
m3=pal(nrow(meta_mat))[meta_mat$inter]
)
hh = heatmap.3(as.matrix(mat),
dendrogram = 'both',
distfun = function(x){as.dist(1-cor(t(x)))},
hclustfun = function(x){hclust(x,method = 'ward.D2')},
col = rev(brewer.pal(10,'RdBu')),
Rowv = TRUE, Colv = TRUE,
ColSideColors = as.matrix(color_matrix)
)
...不好看
把heatmap.3中的树移植到ComplexHeatmap::Heatmap中去：
ComplexHeatmap::Heatmap(mat,name='mat',
column_title = 'test_mat',
right_annotation = row_ha,
col = rev(brewer.pal(10,"RdBu")), # 热图的颜色
column_dend_height = unit(3,"cm"), # 设置树的大小
# 换成hh的术，并且设置一个对聚类树的分割及上色，在h=2.5处分簇并着色：
cluster_columns = dendextend::color_branches(hh$colDendrogram,
h = 2.5),
show_column_names = F # 不显示column name
)