拭子RNA提取试剂的选择

       目前，主流的RNA提取方法有Trizol法、离心柱法和磁珠法。其中，Trizol法与离心柱法相比，提取效果相当，但因其对操作者带来的毒性，现在越来越被弃用。磁珠法可以针对大批量样本处理，适合机器自动化提取，但是提取核酸纯度低，提取得率低，且使用成本较高。对于拭子RNA含量较低的样本或比较珍贵的样本或样本总数不是很多的实验室，首选的拭子RNA提取方法应是离心柱法。

       近来，随着基因诊断技术的发展，从口腔拭子、泌尿生殖道拭子、痰液等样本中进行RNA提取的试剂盒的应用价值越来越大，如肿瘤早期诊断、遗传病检测和病原体感染核酸检测等。拭子RNA提取效果在很大程度上取决于采样质量、试剂盒性能等，特别是试剂盒的性能大大影响了拭子核酸的基因检测和各种研究的开展。

       一般来说，科研用户的样本量不太多，首要的还是提高核酸纯度和提取效率，因而科研用户主要选择离心柱法。大型医疗机构样本量较多，会倾向于选择自动化的磁珠法。但一些样本量不太多的临床医院或检测机构，出于方便和准确诊断的要求，还是会选择离心柱法。出于使用成本的考虑（自动化磁珠配套试剂盒的价格一般是离心柱法的1.5-2.5倍），有些规模较大的医院，也更愿意选择离心柱法。特别地，对一些低丰度样本的检测，最好不要用磁珠法，而是选择离心柱法，否则可能会导致假阴性结果。

       目前国内常用的离心柱法拭子RNA提取试剂盒有国际品牌Q、国内品牌Biog、国内品牌T等。面对各种品牌的离心柱法提取试剂盒，如何选择适合自己实验的提取试剂呢？我们就这些拭子RNA提取试剂盒进行比较。

一、应有较高的提取得率。对离心柱法而言，拭子核酸得率的高低，主要取决于离心柱对核酸的吸附能力、洗脱能力以及裂解液的裂解消化能力。离心柱的硅胶膜RNA吸附性能好、裂解液细胞裂解能力强、洗脱液洗脱能力好，核酸的提取得率就高。反之，如果离心柱硅胶膜吸附能力不好，裂解液和洗脱液没有经过很好的优化，RNA的提取得率就不高。至于RNA提取得率的确定，我们可以使用紫外分光光度法，但是不能作为判断得率的唯一标准，最好还是要做个PCR或荧光定量。拭子样本的量与提取的核酸量成正比，如果要提高核酸得率，也可通过增加样本量来实现。一般先取一根拭子的涮洗液样本，然后进行提取，如结果不理想可考虑增加样本量或重新采样。但如果增加样本量或重新采样还不能得到满意结果，应及时考虑更换试剂盒。目前国内常用的拭子核酸提取试剂有Q、Biog等。根据我们的经验，Q和T品牌试剂盒的拭子RNA提取得率（一根口腔拭子在口咽部来回刮擦10次）在0.5-3.5ug。同样处理的口咽拭子，Biog试剂盒的提取得率在1-4ug，基本上都能满足下游PCR相关实验的要求。

 二、提取的核酸纯度要高。一般通过测定OD260/OD280比值来估计核酸纯度。一般RNA 溶液OD260/OD280比值应在1.8--2.0之间，如果提取的RNA溶液OD260/OD280比值小于1.8，通常说明有蛋白质或酚、多糖等的污染。如果提取的RNA溶液OD260/OD280>2.0，则表明RNA有降解。不同品牌的试剂盒提取的RNA纯度略有差别，Biog的核酸提取纯度比Q略低，可以直接应用于核酸检测以及分子杂交等各种常规分子生物学实验。Q的纯度略高，除了以上应用，还可用于对纯度要求略高的实验。但是一般来讲，目前的拭子RNA提取主要应用于基因与核酸检测等，国产试剂盒Biog都能满足要求。

 三、操作简便性。操作简便性也是拭子RNA提取试剂选择的一个重要因素。操作过于复杂，不仅费时费力，还容易导致样本间的交叉污染，也容易损失样本。特别是用于临床检测或样本量较多情况下的检测，操作复杂如果导致交叉污染会引起误诊，还会影响出检测报告的时间。因而，选用操作简便、流畅的提取试剂盒非常重要。就我们曾经用过的以上三种提取试剂盒来说，Q公司的拭子RNA提取试剂盒提取过程大约25min，从样本处理开始需要10个步骤；T公司拭子RNA提取试剂盒整个提取过程需要1个多小时，从样本开始处理10个步骤；B公司的Biog拭子RNA提取试剂盒提取过程大约20min，从样本开始处理7个步骤，B公司的拭子RNA提取试剂盒在操作简便性上具有一定优势，更适合于较多样本的检测。据了解，该产品已通过药监局备案，也更适合临床样本的检测。

 四、产品价格。价格也是选购产品的重要考量因素。对于绝大多数实验如Northern杂交、RT-PCR、Real Time RT-PCR、cDNA文库构建等，国产试剂盒都能满足质量要求。与国外知名品牌相比，国产试剂盒的价格较为便宜，如Biog，价格还不到国外品牌价格的30%，性价比较高。因而，对于以上实验建议选用Biog等国产试剂盒。一些经费不是很多的课题研究或样本量较大的临床检测项目，特别适合选用国产试剂盒。

五、综合以上，与国外知名品牌相比，国产试剂盒在拭子RNA提取纯度上略有不足，但不影响大多数实验，特别是下游需要PCR扩增的实验和分子杂交类实验。在提取得率上，国内试剂盒与国外品牌差别不大，而在价格方面，国产试剂盒具有比较明显的优势。如果经费充足，RNA纯度要求特别高，可考虑选择Q等国外知名品牌。如果经费不多或下游主要做PCR或分子杂交等实验，可考虑选择性价比较高的Biog等国产品牌。