本地化BLAST+进行目标序列比对

举个栗子：

最近对拟南芥中的一个叫做CBF的基因非常感兴趣，现在我想看看这个CBF基因在一个新测序的物种Am基因组上是否存在，Am中有几个CBF基因？这样的查找可以通过本地化的BLAST+来实现。

关于BLAST:
BLAST软件能够将一个目标蛋白或核苷酸序列(称为查询query)与一个数据库进行比较，并识别某个特定阈值以上的与目标序列相似的库序列。在线的BLAST功能只需要将序列输入，然后BLAST，最后会给出相似的库序列(按照同源性高低排列)。在线BLAST明显存在两个缺陷：1.目标序列BLAST后的得到的库序列是多个物种的，如果我们只是要特定物种的话，还需要再自己找。2.如果目标序列有很多，则需要执行很多次，效率低。而本地化的BLAST+能很好的解决上面两个问题。

开始吧：

1.BLAST+的下载与安装

搜索BLAST，点击网页中的下载选项，针对不同的平台(linux,mac,windows)选择性的进行安装，如图一。
下面以mac为例进行介绍：

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安装好之后打开Terminal，输入"blastn"，出现下图说明安装成功。

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2. 数据准备

BLAST可以搜索核酸或者蛋白序列，下面以蛋白序列为例，之所以用蛋白序列是因为后期我想要用蛋白序列画进化树~

首先准备目标序列的fasta文件，即我感兴趣的CBF基因的fasta文件。首先在NCBI上下载到拟南芥的CBF基因的蛋白序列，拟南芥共有三个CBF基因，分别是CBF1，CBF2 和CBF3。PS：fasta文件可以用Sublime Text文件查看。

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接下来准备目标物种的全部蛋白序列，因为文章还没发表，所以我用的物种名称用Am代替。已发表基因组的物种蛋白序列可以在NCBI上下载，同样是fasta格式。

3. 运行BLAST

回到Terminal，开始运行BLAST。

①设置工作路径：cd /Users/mac/Desktop/CBF-Tree/ （此处根据自己文件存放的文件夹做调整）

②自定义数据库
也称为格式化数据库。在本例中，是指将Am的蛋白序列设为目标数据库：makeblastdb -in Am_pro.fa -dbtype prot
参数说明：
-in 待格式化的序列文件
-dbtype 数据库类型，prot或nucl分别表示蛋白库或核酸库

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③目标序列与库序列进行比对
在本例中，是指将拟南芥的CBF的蛋白序列与Am的蛋白序列进行比对：blastp -query AtCBF.fasta -db Am_pro.fa -out AtCBF_Am.txt -evalue 1e-5 -outfmt 6
参数说明：
-query：输入文件名，代表的是要进行blastp的拟南芥CBF蛋白序列文件
-db：为前面格式化了的Am的基因组蛋白序列文件
-out：输出文件名
-evalue：为筛选标准(设置输出结果的evalue值，evalue越低，相似性越高)
-outfmt：输出文件格式，总共有12种格式，6是tabular格式对应BLAST的m8格式

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outfmt 6生成的表格中每一列分别是：
第一列为: Query(递交序列)，
第二列为: 数据库序列(目标序列subejct)，
第三列为: identity
第四列为：比对长度
第五列为：错配数
第六列为：gap数
第七列和第八列为：Query开始碱基位置和结束碱基位置
第九列和第十列为：Subject开始碱基位置和结束碱基位置
第十一列为：期望值
第十二列为：比对得分

Q&A：返回的txt文件是空文件怎么办？
blastn 最后一个参数 -outfmt 6是将结果变成一个表格输出来。如果query序列在目标数据库里没有同源基因或者没有同源序列，就没有匹配结果，这样-outfmt 6就无法用表格输出来，这样输出的txt文件会显示为空文件。解决方案是将-outfmt 6这个参数去掉，这样返回的是你要的txt文件，文件中会显示no hits。

Q&A: 用blast进行短序列搜索（20nt左右）
如果query序列是很短的序列，如为了扩增某个基因设计了一个20bp的引物，要看看这个引物对目标基因是否具有唯一性的时候，用上述代码是跑不出结果的，这时候要加上另外的参数：-task blastn-short -word_size 7 -evalue 1，具体情况请参照参考文献3。

4. R studio中提取输出文件中同源性最高的序列

输出的结果按照同源性从高到低排列(目标序列与库序列进行同源比对时根据evalue筛选出来的可能不止一个)，那么如何选出每个最匹配的呢?

打开R studio，输入以下代码，即可实现。

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图中是生成的结果。

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补充资料：
BLAST+与BLAST相比，有很多改进和提高，NCBI强烈推荐放弃BLAST，使用BLAST+， 这里说的BLAST和BLAST+，都是本地的，与之前的那个批量BLAST小程序不是一回事。BLAST下载地址：NCBI BLAST+ 。BLAST+的一般用法如下：

格式化数据库
makeblastdb -in db.fasta -dbtype prot -parse_seqids -out dbname
参数说明:
-in：待格式化的序列文件
-dbtype：数据库类型，prot或nucl
-out：数据库名

蛋白序列比对蛋白数据库（blastp）
blastp -query seq.fasta -out seq.blast -db dbname -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_descriptions 10 -num_threads 8
参数说明:
-query： 输入文件路径及文件名
-out：输出文件路径及文件名
-db：格式化了的数据库路径及数据库名
-outfmt：输出文件格式，总共有12种格式，6是tabular格式对应BLAST的m8格式
-evalue：设置输出结果的e-value值
-num_descriptions：tabular格式输出结果的条数
-num_threads：线程数

核酸序列比对核酸数据库（blastn）以及核酸序列比对蛋白数据库（blastx）
与上面的blastp用法类似：
blastn -query seq.fasta -out seq.blast -db dbname -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_descriptions 10 -num_threads 8
blastx -query seq.fasta -out seq.blast -db dbname -outfmt 6 -evalue 1e-5 -num_descriptions 10 -num_threads 8

以上的参数说明只是一些常用的参数，完整的参数说明可以用-help查询。

参考资源：

1. 本地化的NCBI BLAST+的安装及使用
   链接：https://www.jianshu.com/p/2f551c0f9060
   来源：

2. BLAST+使用方法
   链接：https://blog.csdn.net/lixiangyong123/article/details/67634935
   来源：CSDN

3.用blast进行短序列（20nt左右）的搜索
链接：https://www.jianshu.com/p/a6ee3d19b832
来源：