扩增子培训小结

扩增子的定义：

扩增子（amplicon）为DNA或RNA扩增的一段核苷酸序列。

扩增子分析

扩增子分析，指的是对生物高度保守的DNA序列进行分析，鉴定生物的种类与含量的方法，是宏基因组学的研究方法之一。

amplicon.jpg

注：以下扩增子均指微生物16S rDNA片段。

扩增子的分析流程：

采样

采集微生物标本信息。

提取DNA

提取样本中的DNA。

加接头（adapter）

接头，是一段短的序列已知的核酸链，用于链接序列未知的目标测序片段。
将样本DNA打碎，加入接头。

加barcode

barcode，也称为index，是一段很短的寡居核酸链，用于在多个样品混合测序时，标记不同的样品。
由于高通量测序每一次测序的量很大（4-5G），而16S的数据量（45-50M）比较小，每一次测序如果只是对几百个16S样本进行测序的话，那就会有较多的测序通量没有使用，所以，为了提高使用量，节约成本，将多个样本混合在一起，然后一次测序。

测序

将样本放入illuminate测序仪器测序。

质控

原始数据拼接；
去掉低质量的序列；
去掉barcode；
去掉adapter；
去除低丰度的序列；

聚类生成OTU表

基于97%的相似度聚类，生成OTU。

物种注释

将代表性OTU序列与Green Gene数据库比对，得到物种信息，并去除嵌合体，得到物种信息表；

多样性分析

分析之前，先进行标准化，进行抽平。
对样本内微生物多样性进行分析（alpha多样性）
对样本间微生物多样性进行分析（beta多样性）

功能基因预测

采用PICRUSt软件，将物种序列比对到KEGG数据库，对菌群的整体功能进行预测。

挑选差异物种

采用随机森林模型，对两组信息进行分析，筛选出合适的biomarker。