Nature子刊：自闭症患者非典型的功能连接梯度

自闭症谱系障碍(ASD)是一种具有高度复杂行为表型的持续性神经发育障碍。在过去的几十年里，它的概念经历了几次转变。早期的研究方法强调了非典型的感觉加工，而最近的研究集中在高级认知和社会功能的缺陷上，包括心理理论和更一般的预测能力的损害。尽管目前已经对自闭症的大脑基础进行了大量的研究，但低水平和高水平功能异常的共现和相互作用的神经生物学框架仍有待建立。

经典的神经解剖学和脑成像为整个神经发育过程中大脑网络层级的出现提供了大量支持，这种结构被认为可以引导感觉输入沿着多个皮层中继传播到跨模态区域。该体系结构被假定为支持抽象概念、认知和行为的整合。对大脑结构和功能的网络分析证实了连接体组织的总体分层原则。具体地说，研究表明，一方面，包含感觉和运动区的网络外围区域具有更多的局部聚类连接，另一方面，富人俱乐部（rich-club）核心统筹了远距离连接，并充当跨模态整合的骨干。这一层级系统有助于促进抽象的、更高层级的认知功能，因为它有助于将反映当前环境处理的信息与出现在多模态综合皮层中的更多自我生成的操作分开。由于自闭症与感觉加工和心理理论等高级功能缺陷有关，目前的研究评估了宏观层级结构的改变是否可以提供与这种情况相关的各种症状的简单解释。

静息态功能磁共振成像(rs-fMRI)分析提供了一种以可重现的方式描述宏观功能网络的非侵入性手段。许多rs-fMRI研究都集中在ASD中连接异常的图谱上，但到目前为止，在基础的位置和连接变化的性质方面几乎没有一致意见。这种不确定的模式可能是由许多因素造成的，包括研究的特定孤独症人群、检查的功能系统和采用的分析方法的不同研究。在图像采集和信号质量期间头部运动的影响，以及不一致的图像处理程序等，也被认为是潜在的变异来源。尽管存在这些挑战，rs-fMRI仍旧为研究者提供了一个独特的视角来研究不同功能系统之间的相互作用，并评估区分大脑中外围系统和核心系统的网络层级原理。特别是，最近基于非线性连接体压缩技术的研究显示，在一大群健康个体中，沿着皮层表面的连通性可以将功能连接分化为不同的人脑主要梯度。与基于聚类的、将大脑分解为离散区域或最近开发的连通性边界映射技术不同，皮层范围的梯度映射技术描述了系统水平的网络连接的连续变化轴，该系统一端为感觉和运动网络，另一端为默认网络(DMN)，这与早期灵长类追踪工作中建立的功能连接层级一致。值得注意的是，早些时候由其他研究小组开发的互补模拟方法，即所谓的逐步式功能连通性分析(stepwise functional connectivity analysis, SFC)，已经表明该梯度可以理解为连通性空间中的一系列步。事实上，对健康个体的SFC分析显示，从初级感觉系统到DMN系统的连通性的层级递进是一致的，能有效概括从无监督的连接体的降维中得出的功能连通性梯度。

在本文中，作者研究了一种假设，即ASD的低水平和高水平症状都可能来自大脑皮层功能层级的紊乱。他们使用了一种新的连接体梯度方法和SFC（逐步功能连通性）分析的组合，为ASD脑网络异常提供了新的研究证据。事实上，梯度映射是无监督降维的结果，它可视化了假设的大脑皮层层级结构下的连通性变化的拓扑特征，SFC则是从先验定义的感觉种子开始，其映射从外围节点到核心节点的连通性转变。特别是，探索了跨模态联想皮层是否在功能上向ASD的感觉区域移动，这种模式会使感觉输入更难被忽视，并且会通过阻止内部驱动的认知过程分离而损害高阶认知。作者对患有自闭症且通常处于发展中的对照组的大型多中心数据集的分析显示，自闭症患者的功能梯度受到干扰，显示跨模态和单模态区域之间的功能距离缩短。值得注意的是，虽然ASD在SFC中表现出从感觉系统到早期多模态系统的初始加速，但到跨模态区域的过渡是异常的，并且未能在DMN核心上收敛。

ASD中的梯度和SFC发现也与图论指标相关联，特别是连通距离和富人俱乐部特征，提供了一个关于皮层层级的补充观点。ASD中的非典型梯度和逐步式连通性主要与长距离连通性的选择性中断有关，难以有效地激活富人俱乐部节点。最后，监督学习模型成功地利用层级结构特征预测了ASD患者社会认知和重复行为症状领域的症状严重程度，如ADOS（孤独症诊断观察计划）。并且，作者在一个独立的验证数据集中对主要结果进行了有效的重复验证。综上所述，这项研究表明，ASD患者的脑功能特征是大规模皮层网络层级结构的紊乱，为其低水平和高水平症状的矛盾组合提供了简单的解释。本文发表在NATURE COMMUNICATIONS杂志。

方法

被试。这项研究选取了两个数据集（ABIDE-I和II），这两个数据集选自公开共享的自闭症大脑成像数据协议（http://fcon_1000. http://projects.nitrc.org/indi/append）。作者选择了那些包括患有自闭症的儿童和成人以及典型对照组（n=287；143名ASD患者，144名健康对照）。患有自闭症的个体接受了结构化或非结构化的面对面访谈，并被诊断为孤独症、阿斯伯格症或普遍性发育障碍，这些疾病由专家临床意见确定，并由“金标准”诊断。通过WASI、WAIS III和/或WISC III测量全量表/表现/言语智商。对照组没有精神障碍史，并且在位置和年龄上与ASD组进行统计匹配。在ABIDE-I和II数据集中，对照组和ASD组在年龄和性别上没有差异。

MRI处理。

结构MRI处理基于FreeSurfer处理(v5.1；http://surfer.nmr. http://mgh.herard.edu/)。图像处理包括强度校正、立体定位配准、强度归一化、颅骨剥离和白质分割。将灰质体素在皮层表面上分割为各半脑16k个vertex。

rs-fMRI分析是基于预处理连接体计划之前提供的预处理数据(http://preprocessed-connectomesproject.org/abide/)。

处理基于C-PAC(https://fcp-indi.github.io/))工具包，包括时间校正、头部运动校正、颅骨剥离和强度归一化。基于前5个主成分以及线性/二次趋势，使用CompCor工具的统计校正消除了头部运动、白质和脑脊液信号的影响。经过带通滤波(0.01-0.1 Hz)后，通过线性和非线性变换在MNI152空间中共同配准rs-fMRI和T1w数据。对每个病例的皮层表面对齐进行了验证，并沿着中等厚度表面对体素方向的rs-fMRI时间序列进行了插值。作者将rs-fMRI表面数据重采样到Conte69，一个来自人类连接体项目的皮层模板(https://github.com/ Washington-University/Pipelines)，并应用基于表面的平滑(半高宽=5 mm)。作为MRI质量控制的补充，结构性MRI的表面提取的信噪比和视觉评分的评估，以及rs-fMRI的时间导数和逐帧头动位移的评估。

对皮层表面提取情况进行视觉检查。排除严重分割错误、其他伪迹或移位超过0.3 mm的被试。其余所有病例的分割错误均被手动纠正。

连接梯度分析。

为了提高计算效率，皮层数据被进一步降采样到每个半球10k个顶点。基于开放软件(https://github.com/NeuroanatomyAndConnectivity/gradient_analysis)为每个被试生成了大脑皮层范围的连接体梯度。使用每个被试的rs-fMRI时间序列矩阵，基于系统的皮尔逊相关性计算功能连接体。这项研究对该矩阵进行了z变换和阈值处理，只保留了每行前10%的加权连接，并计算了一个余弦相似度矩阵，该矩阵捕获了顶点之间连通性特征中的相似性。作者应用弥散谱嵌入方法（diffusion embedding），一种非线性流形学习方法，以降序方式识别解释连接体方差的主梯度成分。值得注意的是，该算法由单个参数α控制，该参数控制采样点密度对流形的影响(α=0，最大影响；α=1，无影响)。在本研究中，将α设置为0.5，这一选择保留了嵌入空间中数据点之间的整体关系。在基于ASD和对照组的平均连接性矩阵生成的组水平梯度成分模板的估计之后，作者执行Procrstes旋转以将每个个体的成分与模板对齐。

逐步式连通性估计。

逐步功能连通性(SFC)扩展了传统的基于种子的连通性分析，它不仅检测区域间的直接关联，而且还检测沿连续连通性步的间接(但有意义的)关联。它统计在给定的连接距离长度内将给定的皮层区域/顶点连接到目标区域/顶点的所有路径的数量。这项研究中，使用Brain Connectivity Toolbox中的findwalks.m函数为每个被试生成SFC。在梯度映射分析中，使用相同的阈值矩阵作为输入。当SFC的程度随着步数的增加呈指数级增长时，作者通过减去SFC图的整个大脑平均值并除以其标准差来标准化每一步的值。

为了进行综合分析，作者将种子区同时放置在三个有代表性的初级感觉皮层中，包括视觉(V1；MNI坐标x，y，z：−14/10[左/右]，−78，8)、听觉(A1；−54/58，−14，8)和躯体感觉(S1；−42/38，−29，65)区。作者首先评估了自闭症和对照组的组水平模板，然后基于特定被试的连接，在组水平的SFC（逐步功能连通性）的指导下，通过在每一步将其与被试的SFC图相乘来构建单独的SFC图，这样做是为了减少个体水平上观察到的递归SFC计算。在对照组中，SFC映射通常在200步后在DMN中收敛。除了在ASD和对照组中可视化SFC图外，还预估了达到一定层级需要多少SFC步，并使用t检验（双尾）和多重比较校正在各组之间进行比较。

与富人俱乐部的关系。

作者使用了大脑连接工具箱中的函数(https://sites. http://google.com/site/bctnet/）来识别富人俱乐部。为了提高计算效率，将皮层细分为1004个大小相似的分区，计算加权功能连接体（1004×1004），并应用与上述分析相同的阈值。计算了每个个体的富人俱乐部系数φ（k），从1变化到最大程度。对1000个关联的随机网络的φ（k）进行归一化，得到φ范数（k），并确定使对照组和ASD中φ范数（k）最大化的k′。确定了度大于或等于k'的富人俱乐部节点。其余节点被归类为支线(≥10%到富人俱乐部节点的连接）或局部节点（<10%）。

与连接距离之间的关系。

使用gpeyre工具箱计算了所有表面点对之间沿皮质的测地距离(https://github. com/gpeyre/matlab-toolboxes/tree/master/）。对上述阈值函数矩阵进行二值化，只取正连通性，并将其与结果距离矩阵相乘。最终计算该矩阵的行和，并将其除以总节点度，从概念上提供给定区域重要功能连接的平均距离。为了评估自闭症的梯度变化与连接距离之间的关系，作者将基于表面的距离图与主功能梯度组间差异的t-统计图相关联。此外，作者追踪了所有SFC步的平均连接距离。

结果

数据样本。作者研究了来自公开共享的自闭症脑成像数据(ABIDE-I和II)的两个独立的子样本，最终样本为103个ASD和108个对照组(ASD/对照组的平均±SD年龄=20.8±8.1/19.2±7.1)。结构和功能MRI数据的质量指数在ASD组和对照组之间没有差异(双尾Student's t检验：皮层表面提取p>0.27，t=1.08；头部运动p>0.28，t=1.07)。

自闭症的宏观梯度改变。这项研究将弥散图嵌入（一种无监督的非线性降维算法）应用于每个个体的静息态功能磁共振成像（fMRI）衍生的广泛皮层的功能连接体。第一个主梯度解释了数据集中24%的连接体方差（ASD和对照组跨梯度解释了相似的方差，双尾Student's t检验：t=0.87，p>0.38），并显示了渐进的连接轴变化，一端是低水平感觉系统，另一端是跨模态DMN，中间是其他网络（图1a），在健康成年人中复制了最新数据。

图1.自闭症谱系障碍(ASD)和神经典型对照中的连接体梯度图

a.对照组中的主梯度描述了一个连续的坐标系，该坐标系从单模态区域一端延伸到另一端的多模态区域，在DMN中达到峰值。具有相似连接模式的区域显示相似的颜色。

b.整体直方图分析证实，与对照组相比，ASD中的极值被抑制，而在中值范围内的极值增加。

c.对照组和ASD之间的表面范围统计比较，ASD的增加/减少以红色/蓝色显示。

d.对梯度得分(相对于对照组)基于群落的z值分析显示，雷达图(左)和joy图(右)的DMN得分都有显著降低。

将被试的梯度与所有被试的分组模板对齐后，作者使用基于表面的线性模型比较ASD和对照组之间的梯度分数，该模型控制了位置（site）和年龄效应。总体而言，ASD患者皮层范围的梯度受到抑制，表明两端(即感觉网络和DMN)相对于对照组范围收缩，而在中轴梯度增加（图1b）。顶点比较（vertex-wise comparisons）（经过pFWE<0.05的多重比较校正）显示ASD的跨模态内侧前额叶皮层（mPFC）和后扣带/楔前叶（PCC/PCU）的激活减少，同时感觉区和跨模态区之间交界处的早期整合区的激活增加，如枕颞区（OT）和中后颞区（pMTG）（图1c）。通过非参数置换检验获得了类似的结果，尽管显著性低一些。作者应用了一个完善的功能网络分割方法（functional community decomposition）来总结广泛的基于梯度的发现，并发现DMN核心网络的梯度值减少（qFDR<0.05），而感觉运动网络显示出梯度的边际增加的状态（p未校正<0.05；图1d）。

值得注意的是，以显著梯度改变为中心的基于种子的功能连通性分析显示，主要网络的连通性减少了，而不是增加。在transmodel区域，mPFC和PCC/PCU与其他DMN区域的连通性降低，在unimodel、区域，如OT和pMTG与初级感觉和躯体运动皮层的连通性降低。

对于第二个梯度，作者没有观察到ASD和对照之间的任何差异，这表明这种缺陷是主梯度特有的。在控制每个顶点处的第二个梯度时，第一个梯度的差异仍然显著。虽然不同位置对梯度分数变化的影响不同，但每个位置的结果是一致的(mPFC/PCC/PCU的梯度降低的Cohen’s d=−0.5 5/−0.2 4/−0.97；OT/pMTG梯度增加的d=0.37/0.30/0.78)。此外，尽管成人在DMN中表现出更明显的梯度降低(Cohen‘s d儿童/成人=0.29/0.88)，但研究结果发现儿童和成人的情况是相似的，尤其是在早期整合区域（OT和pMTG的Cohen's d儿童/成人=0.73/0.92）。

最后，在第二次ABIDE数据发布（ABIDE-II）的独立样本中证实了梯度结果（pFWE<0.05）。当控制rs-fMRI处理的许多混淆特征时，结果依然很稳健，包括连通性矩阵阈值、整体信号回归（GSR）和全脑连通性移位。具体来说，当使用GSR预处理数据和分析不同阈值连接矩阵（5–25%）时，ASD中改变的梯度模式实际上是相同的。当控制平均全脑连接强度时，结果也相似，表明整体连接移位没有强烈影响。总之，这些对照分析证实，与对照组相比，自闭症患者缺乏功能的宏观整合和局部分离。

逐步式功能连接体分析结果

在证明了ASD中宏观连接体梯度受到干扰后，作者接着考虑了这是否与沿皮层功能层级的非典型转换有关。逐步式功能连通性(SFC)分析可以反复追踪来自初级感觉区的连通性层级(图2)。与之前的研究一致，这项研究从V1、A1和S1开始播种。在对照组中，观察到在穿过中间网络后，DMN中的SFC收敛，在大约100-120步之后，在健康成年人中复制了早期的发现。然而，与对照组相比，ASD表现出干扰性的SFC，即使在200步之后，SFC也不会在DMN内收敛。有趣的是，ASD患者SFC后期步的延迟与早期阶段转换的加速是相互矛盾的，其特征是感觉运动网络、突显网络和注意网络的激活更快(qFDR<0.05)。在对GSR处理后的数据进行重复分析时或对连接矩阵使用不同的阈值以及在控制平均全脑连接强度时，结果是相似的。此外，当将初始种子区域稍微更改为早期工作中公布的感觉种子附近的坐标时，SFC模式和组差异是一致的；值得注意的是，当从中间（非DMN）网络播种时，发现结果也是相似的。最后，复制数据集显示了几乎相同的结果，证实了DMN的SFC（逐步功能连通性）延迟，而不是ASD低水平网络的早期加速。

图2.逐步式功能连接性(SFC)分析。同时结合三种感觉种子(V1、A1、S1)的SFC分析描绘了对照组(左)和ASD(右)的人类多通道整合网络。

为了整合梯度和SFC的发现，作者在一个由前两个梯度构成的坐标系中呈现了SFC的轨迹(图3)，这是之前一些研究中建议的连接体层级的概括性表征。在对照组中，SFC始终从位于底部的感觉和躯体运动网络进化到顶部的DMN核心节点，沿着一条几乎是直线的路径(图3c左侧)。相反，尽管ASD中有一个整体的收缩排列(即DMN的较低主梯度位置，感觉/感觉运动网络的较高位置)，但SFC转换从未在DMN顶部区域完全收敛(图3c右侧)。相反，它们显示了SFC在单模态区的初始加速，随后是延迟转变，最后导致从SFC到DMN变得缓慢和不完整。

图3.整合梯度和关于SFC的发现。

a.前两个连通性的散点图，在对照组和ASD中嵌入梯度。梯度1(y轴)从初级感觉运动到跨模态DMN。梯度2(x轴)将躯体运动和听觉皮质与视觉皮质分开。右侧的直方图显示ASD(浅红色)和对照组(灰色)中的点密度，表明ASD中第一个梯度的整体压缩。

b.事后分析显示，基于表面的分析中四个重要群集的位置移动。

c.梯度空间中的逐步式功能连通性(SFC)。右边的直方图显示点密度，通过累积SFC加权。

与富人俱乐部脑地形和连接距离的关系。

富人俱乐部可能在脑网络的功能交流中发挥重要作用，在脑网络中，高度互连的核心节点与更多局部连接的外围节点是分开的。具体地说，富人俱乐部节点聚合了大多数远距离连接，而外围的局部/支线（feeder）节点显示较短的连接。为了将作者的发现与富人俱乐部的分类和连接距离联系起来，他们比较了富人俱乐部、支线或局部节点中ASD和对照组之间的梯度得分。这一分析表明，在ASD中，富人俱乐部和支线节点的梯度得分较低，而局部节点的梯度分数则有所增加，这表明富人俱乐部核心和外围节点之间的分离程度有所减弱(图4a)。

此外，梯度组差异(即来自组间比较的t-统计量，图1b)与连通性距离之间的广泛的表面相关分析显示出正相关关系(皮尔逊相关：r=0.60，p<0.0001)，支持在距离较长的区域中梯度值优先减小，而在连通性距离较短的主要区域中梯度值增加。当作者沿着SFC的轨迹聚合富人俱乐部参数和解剖距离时(图4b)，作者发现在对照组中，SFC最初沿着局部/支线节点以较短的距离运行，但在大约100步之后距离逐渐增加，并伴随着跨模态富人俱乐部激活的转移。值得注意的是，ASD队列没有表现出选择性的富人俱乐部融合，因此，即使在200步之后，总体连接距离也没有增加。

图4.与富人俱乐部的关系和功能连接的物理距离。

左上角显示了梯度比较和富人俱乐部分类的结果，显示与对照组相比，ASD中的支线节点和富人俱乐部节点的梯度降低，但局部节点的梯度增加。条形图显示平均值±SD。

右上角显示了梯度分数与给定顶点(x轴)的功能连接的平均测地线距离的组间差异的顶点关联。正相关表明具有远距离连接的区域倾向于呈现梯度减小(皮尔逊相关系数r=0.6)。

左下角显示了作为对照组和ASD中SFC步的访问节点的比例，说明了100-200个步中活跃的富人俱乐部与局部节点的比例较低。

右下角显示自闭症患者的平均连接距离在这些较高的步中显著缩短，这是使用带多个比较校正的t检验建立的。

与症状严重程度的关系

最后，作者利用监督式统计学习来测试网络层级特征是否可以为ASD的高水平和低水平症状提供共同的解释。使用5次交叉验证(其中分类器在4次数据上重复训练并在第5次数据上进行测试)，作者发现梯度和SFC特征显著地预测了ADOS总分(平均平均误差，MAE=2.42，r=0.43；表现超过机会水平的置换检验p<0.001)、ADOS子分数(MAE=1.91，r=0.31；p<0.006)和重复行为/兴趣（MAE=1.07，r=0.20；置换检验p<0.04）。沟通分量表的预测效果不显著(置换检验p>0.3)。选定的特征在不同的分类中有所不同，但最一致的包括跨模态DMN(43%)和初级感觉区域(视觉：17%，感觉-运动：10%)(图5)。与先前的研究结果一致，即交叉验证的准确率受样本量的影响，当使用leave-one-site-out策略而不是5倍交叉验证来预测ADOS总分时，分类器的准确率下降，但仍高于预测ADOS总分的随机概率(MAE=2.092.26，r=0.290.30，置换检验p<0.003)。对沟通和重复行为的预测均未达到显著性水平(置换检验p>0.1)。

图5.与ASD症状严重程度的关系。

a.在梯度和SFC特征上训练具有5倍交叉验证的监督式学习算法，以预测ASD患者的ADOS总分和子分数。ADOS总量表和社会认知和重复行为/兴趣子量表具有显著的准确性。

b.在交叉验证的100次迭代中选择特征，以暖色显示频繁选择的特征。基于社区的分层表明，大多数特征是在视觉、突显网络和DMN中选择的。

c.子域预测（即社会认知、沟通、重复行为/兴趣）。

3.讨论

网络层级结构以其并行、模块化的体系结构被广泛认为是人脑组织的关键原则。已经在多个子系统中被观察到网络层级结构，包括感觉、运动和更高水平的多模态网络。人们认为，层级结构可以引导信息在大脑皮层中流动，使感官信号越来越多地与其他信息联系在一起，并转化为更抽象的表征。这一架构还将感觉运动与外部世界的互动与支持复杂推理但需要与外部输入区分的现有表征自然地分开，例如与他人互动时。由于ASD有跨越多个功能域的信息处理障碍，在这里，这篇文章基于一种先进的连接体分析的新组合，在ASD和神经典型对照的两个大样本中研究了皮层功能层级的模式。事实上，这项研究的连接体梯度图显示，两组人都表现出一个连接轴的变化，低水平的感觉系统和在相对的两端的跨模态DMN以及其余介于两者之间的网络。然而，在ASD中，与神经典型组相比，这种梯度是整体收缩的。与这些结果一致的是，SFC的互补分析还表明，在ASD中，感觉驱动的连接性转变并不收敛于多模态区域。结果的进一步图形理论分层揭示了与未能有选择地激活富人俱乐部核心有关的层级失衡，这表明网络主干切换到整体和远距离网络通信模式的能力降低。总而言之，这篇文章的多种方法为非典型连接体层级结构作为ASD的系统级基础提供了一致的证据，这一发现可以在不同的数据集、参数选择以及控制运动和各种方法混乱时重复。

目前的结果表明，ASD在感觉系统和单模态区域(如pMTG和OT)和多模态中枢(如mPFC和PCC/PCU)之间的分离减弱。在典型的发育个体中，OT和pMTG在前馈和反馈流整合中的重要作用以前已经在视觉和听觉系统中发现，特别是对于面孔和语言加工。DMN核心节点，如mPFC和PCC/PCU，在自我参照和内省认知以及包括心理化在内的其他定向认知视角获取操作中是最为一致激活的区域之一。同样，这些加工在ASD中严重受损。在这些和其他皮层节点上，先前的一系列rs-fMRI研究已经报道了一系列结果，表明ASD的功能连接性改变。然而，这些发现在位置和方向上显得不均匀。

事实上，早期中等样本量的研究主要集中在DMN区域，与对照组相比，大部分报告了ASD的连接不足，而其他研究报告了一些例外。这些异质性结果部分归因于研究参数、参与者纳入标准、影像采集、处理和数据质量控制的多样性。然而，最近更多的研究集中在大样本的宏观网络上，通过揭示ASD相关疾病的过度连接和连接不足的同时存在，调和了看似不一致的连接中断。这种镶嵌模式（mosaic pattern）似乎与所采用的功能环路有关，根据目前的研究结果，皮层-皮层网络在ASD中基本上被描述为低连接，而皮层下环路似乎是过度连接的，特别是在丘脑和躯体运动皮质之间。几乎没有最近的研究支持这一新兴概念，即ASD的内在功能连接网络可能是以特殊方式组织的，其中ASD在功能网络组织方面比对照组表现出更大的变异性，在默认网络和躯体运动连接中有更强的影响。总而言之，这些发现表明，更广泛的ASD表型可能源于个体之间的功能结构失衡，这些失衡并不纯粹依赖于空间限制，而是依赖于网络水平的特征。

总结：

总而言之，作者在本文中使用的基于逐步式连接体的分析和梯度的分析基于了一个功能网络层级架构的总体假设，在这个假设下，作者可以在一个统一的框架内解释ASD的不同行为表型，而不是只针对特定的功能环路。结合梯度和逐步式功能连接体的方法提供了对传统的基于分区的宏观大脑组织和连通性研究的补充观点，并且避免了定义离散网络的需要。

虽然作者的方法也利用了与先前的分区研究类似的区域之间的功能连接性的信息，但是梯度映射进一步将这些信息投射到非线性扩散空间中，并识别描述了皮层连通性变化中的主要的拓扑变化。因此，由此产生的梯度分数并不是简单地概括网络的相关性/反相关性，而是反映了在网络水平不同网络之间的拓扑距离。

除了为自闭症中的连接异常提供一个新的视角外，这项研究还将更传统的图论的富人俱乐部方法以及皮层测地线距离纳入到分析流程中。使用这种方法，作者发现富人俱乐部节点在梯度分数上表现出最强的降低，并且与那些具有短距离功能连接特征的俱乐部节点相比，在具有远距离连接的区域中观察到更明显的减少。

总体而言，这项研究的结果与以前的研究结果是一致的，即ASD的特征是这个核心子网络的空间和拓扑水平的重组。因此，除了概括先前的的研究结果外，作者的方法还提供了作为ASD系统水平基础的非典型连接体皮层层级的更直接的测量。这些客观标记物的可获得性将允许对疾病进行进一步检查，以确定特定和跨诊断的非典型性，这一努力正通过共享跨诊断样本，如健康大脑网络（https://healthybrainnetwork.org）而变得更加接近。

最后，作者还强调了数据质量在不同位置的可变性，这项研究的工作包括广泛的病例筛选、几次统计校正和验证实验，以证实发现的稳健性。具体地说，作者验证了在MRI质量和运动变化方面的结果，在发现数据集中观察到类似的主效应，并在第二个ABIDE波中复制了独立验证队列中的发现。总的来说，这篇文章是将梯度研究和传统静息态功能网络研究结合起来的典范研究案例，值得认真学习！