Monocle3
一、monocle3介绍
monocle3可以执行的3个主要的功能
对细胞进行聚类、分类和计数。Monocle 3 可识别新的（可能是罕见的）亚型细胞
构建单细胞轨迹。通过拟时序分析帮助大家解析生物体发育、疾病等过程中细胞发生的变化。这是最主要的功能。
差异表达分析。Monocle 3 包括一个复杂但易于使用的差分表达系统，可以表征新的细胞类型和状态始于与其他更好理解的细胞进行比较。
主要流程
1.读取数据，创建cell_data_set对象。
2.数据预处理：标准化，去除批次效应
3.降维
4.聚类
5.进行差异基因表达分析
6.拟时序分析
二、关于不同数据的读取办法
（一）Bioconductor的ExpressionSet对象：
monocle3读取的数据要包含3个部分：
- expression_matrix：表达式值的数字矩阵，其中行是gene，列是cell
- cell_metadata
:数据框，其中行是cell，列是细胞属性（如细胞类型、培养条件、获取日期等） - gene_metadata
:数据框，其中行是特征（例如基因），列是基因属性，例如生物型，GC含量等。
输入前应该确保几个“等式”
- expression_matrix 列数= cell_metadata 行数 并且两者要相匹配
- expression_matrix 行数= gene_metadata 列数 并且两者要相匹配
- gene_metadata的其中一列应为“gene_short_name”,表示每个基因的基因符号或简要名称
创建对象示例
# Load the data
expression_matrix <- readRDS(url("https://depts.washington.edu:/trapnell-lab/software/monocle3/celegans/data/cao_l2_expression.rds"))
cell_metadata <- readRDS(url("https://depts.washington.edu:/trapnell-lab/software/monocle3/celegans/data/cao_l2_colData.rds"))
gene_annotation <- readRDS(url("https://depts.washington.edu:/trapnell-lab/software/monocle3/celegans/data/cao_l2_rowData.rds"))
# Make the CDS object
cds <- new_cell_data_set(expression_matrix,
cell_metadata = cell_metadata,
gene_metadata = gene_annotation)（二）从 10X 输出生成cell_data_set
要找到正确的文件，必须提供包含未修改的Cell Ranger“outs”文件夹的文件夹的路径。文件结构应如下所示：10x_data/outs/filtered_feature_bc_matrix/，其中filtered_feature_bc_matrix包含 files features.tsv.gz、barcodes.tsv.gz 和 matrix.mtx.gz。（还可以处理Cell Ranger V2数据，其中“feature”被替换为“gene”，并且文件未被gz压缩。(这个读取起来很容易报错)
读取示例:注意使用函数是load_cellranger_data
# Provide the path to the Cell Ranger output.
cds <- load_cellranger_data("~/Downloads/10x_data")或者如果有以下3个文件，也可直接读取：注意使用函数是load_mm_data
matrix.mtx, feature.tsv 和barcodes.tsv
cds <- load_mm_data(mat_path = "~/Downloads/matrix.mtx",
feature_anno_path = "~/Downloads/features.tsv",
cell_anno_path = "~/Downloads/barcodes.tsv")（三）处理大量数据
当细胞量或基因量比较大的话，可以使用稀疏矩阵的方法读取
cds <- new_cell_data_set(as(umi_matrix, "sparseMatrix"),
cell_metadata = cell_metadata,
gene_metadata = gene_metadata)（四）多个cds对象组合
# make a fake second cds object for demonstration
cds2 <- cds[1:100,]
big_cds <- combine_cds(list(cds, cds2))二、数据预处理
（一）数据标准化
cds <- preprocess_cds(cds, num_dim = 100)#主要是完成数据的标准化＋PCA
plot_pc_variance_explained(cds)#查看的是每个维度的变异分数
cds <- align_cds(cds, alignment_group = "plate")#去除批次效应查看每个PC的变异分数：plot_pc_variance_explained()
（二）降维分析并可视化
Monocle 3默认使用UMAP降维，降维方法有两种可以选择：PCA和LSI，RNA-seq数据选择 PCA，如果是ATAC-seq则使用LSI
cds <- reduce_dimension(cds,preprocess_method = 'PCA')- 降维方法
method = c("PCA", "LSI")，默认是PCA - 默认维度
num_dim是50 - 初步降维前归一化
norm_method默认是log处理 - 设置降维方法是PCA时，自动进行标准化处理
可视化：
plot_cells(cds)
对分群进行着色
colnames(colData(cds))#可以选任意一个进行着色
#[1] "plate" "cao_cluster" "cao_cell_type" "cao_tissue"
#[5] "Size_Factor"
plot_cells(cds, color_cells_by="cao_cell_type")
查看某些基因的表达分布
ciliated_genes <- c("che-1",
"hlh-17",
"nhr-6",
"dmd-6",
"ceh-36",
"ham-1")
plot_cells(cds,
genes=ciliated_genes,
label_cell_groups=FALSE,
show_trajectory_graph=FALSE)
tsne降维
可以看到效果不是很好
#也可以用tsne的方法进行降维，但是效果不好
cds <- reduce_dimension(cds, reduction_method="tSNE")
plot_cells(cds, color_cells_by="cao_cell_type", reduction_method="tSNE")
plot_cells(cds, reduction_method="tSNE",
color_cells_by="cao_cell_type",
cell_size = 2,
group_label_size = 3)
三、细胞聚类（cluster your cells）
这是细胞分群过程中非常重要的一步。Monocle利用Louvain community detection 这个非监督聚类方法（它是phenoGraph算法的一部分），它和我们常见的Kmeans、hclust层次聚类等还不太一样，这个方法更倾向于找到一个网络中联系紧密的部分，而经常忽略节点的特性；而我们常见的聚类呢，它一般会忽视整体中各个部分的联系，而通过计算两个节点(目标)之间的距离（如欧式距离、曼哈顿距离、余弦相似度等） 找到相似的特性
（一）聚类
这里的聚类已经不再是单单的聚类，按照作者的说法，是把细胞进行分区，后去的轨迹分析都会针对这个分区来进行。partition是一些小的cluster的聚合，如果根据cluster进行着色的话会显得比较乱。
cds <- cluster_cells(cds)#聚类之后，每一个cluster会自成一个”拟时序轨迹“
plot_cells(cds, color_cells_by = "partition")
（二）利用learn graph在每个partition中寻找主路径
识别轨迹：对每个cluster进行主成分分析，这步以后拟时序图谱就已经初步产生了
cds <- learn_graph(cds)#对每个cluster进行主成分分析，这步以后拟时序图谱就已经初步产生了
plot_cells(cds,
color_cells_by = "cao_cell_type",
label_groups_by_cluster=FALSE,
label_leaves=FALSE,
label_branch_points=FALSE)
plot_cells(cds,
color_cells_by = "cao_cell_type",
label_cell_groups=FALSE,
label_leaves=TRUE,#展示分支
label_branch_points=TRUE,#展示分支节点
graph_label_size=1.5)
- 图中的黑线就是整个架构（注意到整个图并非完全连接的，毕竟是按照partition聚类，每个partition中的细胞差异有点大）；
- 浅灰色的圆圈表示”叶片“表示发育轨迹中的不同结局（可以认为拟时序分析的图是一个”根-茎-叶“结构），用参数
label_leaves控制； - 黑色的圆圈表示分支节点，预示着其中的细胞会有不同发展方向，用参数
label_branch_points控制； - 圈中数字大小表示出现时间的先后
四、拟时序分析
（一）首先告诉monocle3，哪个是轨迹分析的起点
1.手动点击添加
cds <- order_cells(cds)
plot_cells(cds,
color_cells_by = "pseudotime",
label_cell_groups=FALSE,
label_leaves=FALSE,
label_branch_points=FALSE,
graph_label_size=1.5)
展示某些基因在时间轨迹中的表达情况
#某个基因的展示
plot_genes_in_pseudotime(cds[1:5,],
color_cells_by="cao_cell_type",
min_expr=0.5) 
2.代码添加，get_earliest_principal_node()函数可以指定起点的名称，在这里指定Am/PH sheath cells这个细胞类型附近作为起点
#方法一
get_earliest_principal_node <- function(cds, my_select="Am/PH sheath cells"){
cell_ids <- which(colData(cds)[, "cao_cell_type"] == my_select)
closest_vertex <-
cds@principal_graph_aux[["UMAP"]]$pr_graph_cell_proj_closest_vertex
closest_vertex <- as.matrix(closest_vertex[colnames(cds), ])
root_pr_nodes <-
igraph::V(principal_graph(cds)[["UMAP"]])$name[as.numeric(names
(which.max(table(closest_vertex[cell_ids,]))))]
root_pr_nodes
}#选择想要定义为起点的细胞类型
cds <- order_cells(cds, root_pr_nodes=get_earliest_principal_node(cds))#定义起点
#另一种方法
myselect <- function(cds,select.classify,my_select){
cell_ids <- which(colData(cds)[,select.classify] == my_select)
closest_vertex <-
cds@principal_graph_aux[["UMAP"]]$pr_graph_cell_proj_closest_vertex
closest_vertex <- as.matrix(closest_vertex[colnames(cds), ])
root_pr_nodes <-
igraph::V(principal_graph(cds)[["UMAP"]])$name[as.numeric(names
(which.max(table(closest_vertex[cell_ids,]))))]
root_pr_nodes
}
cds <- order_cells(cds,
root_pr_nodes=myselect(cds,select.classify = 'cao_cell_type',
my_select = "Body wall muscle")
#绘图
plot_cells(cds,
color_cells_by = "pseudotime",
label_cell_groups=FALSE,
label_leaves=FALSE,
label_branch_points=FALSE,
graph_label_size=1.5)|plot_cells(cds,
color_cells_by = "cao_cell_type",
label_cell_groups=FALSE,
label_leaves=FALSE,
label_branch_points=FALSE,
graph_label_size=1.5)#两种着色方式
可以看到以pseudotime为依据着色的话，就是以Body wall muscle为起点的紫色区域，序号1就是这个细胞所在区域。
（二）3D版拟时序分析
3D轨迹实际上就是降维时选前3个主成分 => max_components = 3，后续都和2D保持类似
cds_3d <- reduce_dimension(cds, max_components = 3)#降维
cds_3d <- cluster_cells(cds_3d)#聚类
cds_3d <- learn_graph(cds_3d)#轨迹学习
cds <- order_cells(cds,
root_pr_nodes=myselect(cds,select.classify = 'cao_cell_type',
my_select = "Body wall muscle")
)#选择拟时序分析的起点，和前面2D一样，用代码选择起点
cds_3d_plot_obj <- plot_cells_3d(cds_3d, color_cells_by="cao_cell_type")#绘图
五、差异基因分析
差异表达分析，进行基因的轨迹分析，找出哪一些基因在这个轨迹中变化最大，graph_test()这个函数可以进行一个叫做Moran's I 的spatial autocorrelation分析方法
subset_pr_test_res <- graph_test(cds, neighbor_graph="principal_graph", cores=4)#cores是指定核心数运行好之后会得到一个表格，
Moran's I这个指标叫：莫兰指数，澳大利亚统计学家莫兰于1950年提出。它是用来度量空间相关性的一个指标，数据经过方差归一化之后，会落在-1.0和1.0之间。这个值大于0表示空间正相关，值越大空间相关性越强；等于0时空间是随机性分布；小于0时表示空间负相关，值越小空间差异越大
morans_I（空间共表达）,其数值越靠近1代表这个基因在空间距离相近的细胞中表达值越相似，0则代表没有空间共表达效应
基因特征图
#我们这里就按照morans_I的大小来选择前十个基因
top10 <- subset_pr_test_res %>% top_n(n=10, morans_I) %>%
pull(gene_short_name) %>% as.character()
#基因表达趋势图，绘图,画不出来，一直报错。
p <- plot_genes_in_pseudotime(cds[top10,],
color_cells_by="cao_cell_type",
min_expr=0.5,
ncol = 4)
#基因特征图
plot_cells(cds, genes=top10, show_trajectory_graph=FALSE,
label_cell_groups=FALSE, label_leaves=FALSE)
寻找共表达基因模块
这个是寻找module与细胞/cluster/partition的相关性，module是指协同表达的基因模块，每个模块的基因可能有相似的表达趋势。
##寻找共表达模块
genelist <- pull(subset_pr_test_res, gene_short_name) %>% as.character()
gene_module <- find_gene_modules(cds[genelist,], resolution=1e-2, cores = 5)
cell_group <- tibble::tibble(cell=row.names(colData(cds)),
cell_group=colData(cds)$celltype)
agg_mat <- aggregate_gene_expression(cds, gene_module, cell_group)
row.names(agg_mat) <- stringr::str_c("Module ", row.names(agg_mat))
pheatmap::pheatmap(agg_mat, scale="column", clustering_method="ward.D2")