分子生物学知识点归纳

分子生物学

1. DNA的一级结构：指DNA分子中核苷酸的排列顺序。
2. DNA的二级结构：指两条DNA单链形成的双螺旋结构、三股螺旋结构以及四股螺旋结构。
3. DNA的三级结构：双链DNA进一步扭曲盘旋形成的超螺旋结构。
4. DNA的甲基化：DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化。甲基化修饰在原核生物DNA中多为对一些酶切位点的修饰，其作用是对自身DNA产生保护作用。真核生物中的DNA甲基化则在基因表达调控中有重要作用。真核生物DNA中，几乎所有的甲基化都发生于二核苷酸序列5’-CG-3’的C上，即5’-mCG-3’.
5. CG岛：基因组DNA中大部分CG二核苷酸是高度甲基化的,但有些成簇的、稳定的非甲基化的CG小片段,称为CG岛,存在于整个基因组中。“CG”岛特点是G+C含量高以及大部分CG二核苷酸缺乏甲基化。
6. DNA双螺旋结构模型要点：

1. DNA是反向平行的互补双链结构。
2. DNA双链是右手螺旋结构。螺旋每旋转一周包含了10对碱基，螺距为3.4nm. DNA双链说形成的螺旋直径为2 nm。每个碱基旋转角度为36度。DNA双螺旋分子表面存在一个大沟和一个小沟，目前认为这些沟状结构与蛋白质和DNA间的识别有关。
3. 疏水力和氢键维系DNA双螺旋结构的稳定。DNA双链结构的稳定横向依靠两条链互补碱基间的氢键维系，纵向则靠碱基平面间的疏水性堆积力维持。

1. 核小体的组成：

染色质的基本组成单位被称为核小体，由DNA和5种组蛋白H1,H2A,H2B,H3和H4共同构成。各两分子的H2A,H2B,H3和H4共同构成八聚体的核心组蛋白，DNA双螺旋缠绕在这一核心上形成核小体的核心颗粒。核小体的核心颗粒之间再由DNA和组蛋白H1构成的连接区连接起来形成串珠样结构。

1. 顺反子（Cistron）：由结构基因转录生成的RNA序列亦称为顺反子。
2. 单顺反子（monocistron）：真核生物的一个结构基因与相应的调控区组成一个完整的基因，即一个表达单位，转录物为一个单顺反子。从一条mRNA只能翻译出一条多肽链。

10．多顺反子(polycistron): 原核生物具有操纵子结构，几个结构基因转录在一条mRNA链上，因而转录物为多顺反子。每个顺反子分别翻译出各自的蛋白质。

11．原核生物mRNA结构的特点:

(1) 原核生物mRNA往往是多顺反子的，即每分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息。

（2）mRNA 5‘端无帽子结构，3‘端无多聚A尾。

（3）mRNA一般没有修饰碱基。

12．真核生物mRNA结构的特点：

   （1）5‘端有帽子结构。即7－甲基鸟嘌呤－三磷酸鸟苷m7GpppN。

   （2）3‘端大多数带有多聚腺苷酸尾巴。

   （3）分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化。

   （4）分子中有编码区和非编码区。

14．tRNA的结构特点

（1）tRNA是单链小分子。

（2）tRNA含有很多稀有碱基。

（3）tRNA的5‘端总是磷酸化，5’末端核苷酸往往是pG.

（4）tRNA的3‘端是CCA－OH序列。是氨基酸的结合部位。

（5）tRNA的二级结构形状类似于三叶草，含二氢尿嘧啶环（D环）、T环和反密码子环。

（6）tRNA的三级结构是倒L型。D环和T环在L的拐角上。

15．rRNA

（1）rRNA是细胞内含量最丰富的RNA，它们与核糖体蛋白共同构成核糖体，后者是蛋白质合成的场所。

（2） 核糖体和rRNA一般都用沉降系数S表示大小。原核生物核糖体的沉降系数为70S，由50S和30S两个大小亚基组成，30S小亚基含有16SrRNA和21种蛋白质。50S大亚基含有23S和5SrRNA以及34种蛋白质。真核生物沉降系数为80S，由大小亚基组成。40S小亚基含有18SrRNA和30多种蛋白质。60SrRNA含有5S、5.8S和28SrRNA 以及大约45种蛋白质。

16．核酶（ribozyme）：某些RNA分子能催化自身或其他RNA分子进行化学反应，即具有酶样的催化活性，这类具有催化活力的RNA称为核酶。核酶分为3类：(1) 异体催化的剪切型。（2）自体催化的剪切型 （3）内含子的自我剪切型。

17．核内不均一RNA（hnRNA）：真核生物转录生成的mRNA前体即为hnRNA。这类mRNA前体必须经过一系列的加工处理才能变成成熟的mRNA。加工过程的主要环节包括：（1）5‘端加帽 （2）3’端加尾 （3）内含子的切除和外显子的连接 （4）分子内部的甲基化修饰 （5）核苷酸序列的编辑作用。

18．miRNA:是一种单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其特点就是高度的保守性、时序性和组织特异性。研究表明miRNA可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。

19．siRNA：小干扰RNA。是人工合成的短的双链RNA，它可抑制细胞内特定基因的表达，导致转录后基因失活。siRNA是RNAi的重要工具。

20．反义RNA：碱基序列正好和有意义mRNA互补的RNA称为反义RNA。这类RNA也是单链RNA，可与mRNA配对形成双链，最终抑制mRNA作为模板进行翻译，这是反义RNA主要的调控功能。

21．顺式作用元件（cis-acting element）：真核生物基因中的调控序列被称为顺式作用元件,包括：启动子和上游启动子元件，增强子，反应元件，Poly(A)加尾信号。

22．增强子（enhancer）：是一段短的DNA序列，其中含有多个作用元件，可以特异性与转录因子结合，增强基因的转录活性。增强子可以位于基因的任何位置，增强子的功能与其位置和方向无关。

23．基因：是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。一个基因不仅仅包括编码蛋白质肽链或RNA的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列及位于编码区5‘端上游的非编码序列，内含子和位于编码区3’端下游的非编码序列。

24．基因组：泛指一个细胞或病毒的全部遗传信息。在真核生物体中，基因组是指一套完整单倍体DNA和线粒体DNA的全部序列，既包括编码序列，也包括非编码序列。

25．病毒基因组包括：单链正股RNA，单链负股RNA，双链RNA，双链DNA和单链正股DNA。

26．SARS冠状病毒属于：单链正股RNA病毒。逆转录病毒属于：单链正股RNA病毒。

27．逆转录病毒基因组包括三个结构基因：gag、pol和env。分别编码：核心蛋白、逆转录酶和膜蛋白。

28．操纵子（operon）:是指数个功能上相关联的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵序列）和下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。

29．质粒：是存在于细菌染色体之外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。

30．质粒的不相容性：具有相同复制起始位点和分配区的两种质粒不能共存于一个宿主菌，这种现象称为质粒的不相容性。

31．转座因子：既可移动的基因成分，是指能在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。原核生物的转座因子包括：插入序列、转座子和Mu噬菌体。

32．插入序列: 是一类较小的没有表型效应的转座因子，由一个转位酶基因及两侧的反向重复序列组成。

33．转座子：是一类较大的可移动成分，除有关转座的基因外，至少带有一个与转座作用无关的并决定宿主菌遗传性状的基因 。

34．断裂基因：真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔而又连续镶嵌而成，去除编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质这些基因称为断裂基因。

35．snRNA:核内小RNA，分子中尿嘧啶含量最丰富。snRNA和核内蛋白质组成小分子核糖核蛋白体，作为RNA剪接的场所。

36．启动子：能够被RNA聚合酶识别并结合并起始转录的核苷酸序列。典型的启动子包括TATA盒，CAAT盒和GC盒。

37．反应元件：一些信息分子的受体被细胞外信息分子激活后，能与特异的 DNA序列结合，调控基因的表达。这些特异的DNA序列实际上也是顺式元件，由于能介导基因对细胞外的某种信号产生反应，被称为反应元件。

38．基因家族：指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。

39．端粒DNA重复序列：TTAGGG。微卫星DNA常见重复单位(AC)和（TG）。

40．卫星DNA：是出现在非编码区的串联重复序列。其特点是具有固定的重复序列，该重复单位首尾相连形成重复序列片段，通常存在于间隔DNA和内含子中。卫星DNA可分为大卫星DNA、小卫星DNA和微卫星DNA。

41．端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA的末端都有一种特殊的结构，端粒。该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。端粒的功能主要有：保护线性DNA的完整复制，保护染色体末端及决定细胞的寿命等。

42．Alu家族：序列中有限制性内切酶Alu的酶切位点。重复单位是300bp.属短散在核元件，为灵长类基因组所特有。

43．假基因：是指与某些有功能的基因结构相似，但不能表达基因产物的基因。

44．人类基因组的四张图谱：遗传图、物理图、序列图和转录图。遗传图指基因或DNA标记在染色体上以遗传距离表示的相对位置。物理图指基因或DNA标记间的实际距离。序列图指人类基因组的全部核苷酸序列，也是最详尽的物理图。转录图指基因图谱。

45．端粒酶：由三部分组成，端粒RNA，端粒酶逆转录酶，端粒酶协同蛋白。端粒酶兼有提供RNA模版和催化逆转录酶的功能。端粒酶通过一种爬行模型的机制维持染色体的完整。

46. 半保留复制：子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整的接受过来，另一股单链则完全重新合成，两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致，这种复制方式称为半保留复制。

47. 半不连续复制：顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，必须等模板链解开至足够长度，然后从5’-3’生成引物并复制子链。延长过程中，又要等待下一段有足够长度的模板再次生成引物而延长。这股不连续复制的链称为随从链。领头链连续复制而随从链不连续复制，这就是复制的半不连续复制。

48. 冈崎片段：随从链的复制由于与解链方向相反，必须待母链解开足够长度后才开始生成引物接着延长。复制中形成的不连续复制片断就是冈崎片段。

49. 滚环复制：是某些低等生物或染色体外的DNA的复制形式。环状DNA外环打开，伸出环外作母链复制，内环不打开一边滚动一边复制。最后，一个双链环就滚动复制成两个双链环。

50. TT二聚体：在紫外线照射下，相邻的两个DNA分子上的嘧啶碱基之间共价结合而成的。

51. 着色性干皮病：是由于DNA损伤修复有缺陷而造成的一种遗传性疾病，患者有较高的皮肤癌发病倾向。对该病的研究，发现了一些与切除损伤部位有关的蛋白质，称为XP蛋白。

52. 切除修复：DNA损伤修复的一种方式。通过切除损伤部位，剩下的空隙由DNA-pol I催化dNTP聚合而填补，最后由DNA连接酶结合裂隙。切除损伤在原核生物需Uvr蛋白类，真核生物需XP蛋白类。

53. 光修复：生物体内有一种光修复酶，被光激活后能利用光所提供的能量使紫外线照射引起的嘧啶二聚体分开，恢复原来的非聚合状态，称为光修复。

54. DNA损伤的修复类型：光修复、切除修复、重组修复和SOS修复。

55. 重组修复时，recA蛋白被激活，使得LexA蛋白被水解。

56. 突变的分子改变类型：

（1）错配:DNA分子上的碱基配对又称点突变。

(2)  缺失，插入和框移：缺失和插入都可以导致框移突变。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出的蛋白质可能完全不同。

（3）重排：DNA分子中较大片断的交换，称为重组或重排。

57. 点突变分为：转换和颠换。转换是指由一种嘧啶变成另一种嘧啶，或一种嘌呤变成另一种嘌呤。颠换是指由嘧啶变成嘌呤，或由嘌呤换为嘧啶。

58. 突变的意义：

    (1)突变是进化、分化的分子基础。

    (2)只有基因型改变的突变。

    (3)致死性的突变。

    (4)突变是某些疾病的发病基础。

59. D－环复制：是线粒体DNA的复制形式。复制时需合成引物。MtDNA为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸，最后完成两个双链环状DNA的复制。

60. 逆转录酶有三种活性：

(1)RNA指导的DNA聚合酶活性。

(2)DNA指导的DNA聚合酶活性。

(3)RNA酶H（RNaseH）活性。

61. RNA复制：是指某些病毒在宿主细胞中以自身RNA为模板，以宿主细胞中的4种dNTP为原料，按5’-3’方向催化合成互补的RNA链，此过程称为RNA复制。

62. 逆转录：是指以RNA为模板，利用宿主细胞中4种dNTP为原料，按5’-3’方向催化合成与RNA互补的DNA链的过程。

63. 逆转录病毒复制过程：

   （1）逆转录酶以RNA为模板，催化dNTP聚合生成DNA互补链，产物是RNA/DNA杂化双链。

  （2）杂化双链中的RNA被逆转录酶中有RNA酶活性的组分如RNaseH水解.

   (3)  利用单链DNA为模板，由逆转录病毒催化合成第2条DNA互补链。

64. Klenow片断具有：DNA聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性。

65. DNA－pol I的功能：对复制中的错误进行较读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。

66. DNA复制的保真性依赖的机制：

  （1）遵守严格的碱基配对规律。

  （2）聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能。

  （3）复制出错时有即时的较读功能。

67. 引发体：解螺旋酶，DnaC蛋白，引物酶和DNA起始复制区域组成。

68. 拓扑异构酶作用：

   （1）拓扑酶I 切断DNA双链中的一股，使DNA解链旋转中不致打结，适当时候又把切口封闭，使DNA变为松弛状态。反应不需ATP。

   （2）拓扑酶II 在无ATP时，切断处于正超螺旋的DNA分子双链某一部位，断端通过切口使超螺旋松弛；在利用ATP功能的情况下，松弛状态的DNA又进入负超螺旋状态，断端在同一酶催化下连接恢复。

69．复制和转录的异同：

相似之处：

（1）都是酶促的核苷酸聚合反应。

（2）都以DNA为模板。

（3）都需依赖DNA的聚合酶。

（4）聚合过程中都是核苷酸之间形成磷酸二酯键。

（5）都从5‘-3’方向延伸聚核苷酸链。

（6）都遵从碱基配对规律。

区别：

（1）模板。复制：两股链均复制。转录：不对称转录。

（2）原料。复制：dNTP。转录：NTP。

（3）酶。  复制：DNA聚合酶。转录：RNA聚合酶。

（4）产物。复制：子代双链DNA（半保留复制）。转录：mRNA, rRNA, tRNA.

（5）碱基配对。复制：A-T，C-G。转录：A-U，G-C，T-A。.

70．真核生物RNA聚合酶转录产物和对鹅膏蕈碱的反应。

（1）RNA-pol I：转录产物：45S-rRNA 对鹅膏蕈碱的反应：耐受。

（2）RNA-pol II：转录产物：hnRNA  对鹅膏蕈碱的反应: 极敏感。

（3）RNA-pol III：转录产物：5S-RNA, tRNA，snRNA. 对鹅膏蕈碱的反应：中度敏感。

71. 转录：以DNA一条链为模板，以四种NTP为原料，在DNA指导的聚合酶作用下，按照碱基互补原则（ A-U,T-A,G-C）合成RNA链的过程。

72. 不对称转录：转录时因为（1）DNA分子双链一股链用作模板指引转录，另一股链不转录。

（2） 模板链并非总是在同一条链上。故称为不对称转录。

73. 原核生物聚合酶组成：由四种亚基组成α2ββ‘σ五聚体的蛋白质。其中α2ββ’亚基称为核心酶。σ因子辨认起始点。α决定哪些基因被转录。β起催化作用。β’起结合DNA模板（开链）作用。

74．操纵子：转录是不连续、分区段进行的。每一转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子。操纵子包括若干个结构基因及其上游的调控序列。调控序列中的启动子是RNA聚合酶结合模板DNA的部位，也是控制转录的关键部位。

75．电子显微镜下观察到的羽毛状的图形说明：在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行。在RNA链上观察到的小黑点是多聚核蛋白体。转录和翻译都在高效率的进行。

76．转录空泡：由酶-DNA-RNA形成的转录复合物。

77．依赖ρ因子的转录终止：

ρ因子是由相同亚基组成的六聚体，它是原核生物转录终止因子。可结合转录产物RNA 3‘端的多聚C特殊序列，还有ATP酶和解螺旋酶活性。ρ因子与转录产物RNA 3‘端的多聚C结合后，ρ因子和RNA聚合酶都发生构象改变，从而使RNA聚合酶停顿，解螺旋酶活性使DNA和RNA杂化双链拆离，转录产物从转录复合物中释放。

78．非依赖ρ因子的转录终止：

    RNA链延长至终止区时，转录出的碱基序列随即形成茎－环结构。这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。其机制有两方面：一是茎环结构在RNA分子形成可能改变RNA聚合酶的构象。由于酶构象的改变导致酶－模板结合方式的改变，可使酶不再向下游移动，于是转录停顿。其二，转录复合物（酶－DNA-RNA）上有局部的RNA/DNA杂化双链。RNA分子和DNA分子都要形成自己的双链，杂化链形成的机会不大，本来不稳定的杂化链更不稳定，转录复合物趋于解体。接着一串寡聚U是使RNA链从模板脱落的促进因素，因为所有的碱基配对中以U和A的配对最不稳定。

79．TFII的功能：

    TFIID：TBP（TATA结合蛋白）结合TATA盒。TAF（TBP辅助因子）辅助TBP-DNA结合。

    TFIIA：稳定IID-DNA复合物。

    TFIIB：促进RNA-pol II结合及作为其他因子结合的桥梁。

    TFIIF:  解螺旋酶

    TFIIE：ATPase

    TFIIH: 蛋白激酶活性。

80．转录起始前复合物（PIC）：是真核生物转录因子之间先互相辨认结合，然后以复合体的形式与RNA聚合酶一同结合于转录起始前的DNA区域而成。

81．真核生物mRNA转录终止及加尾修饰

    真核生物mRNA转录终止后，紧接着发生加尾修饰。过程如下:在模板链上转录终止点上游约百个或上千个核苷酸处常有一组共同的序列AATAAA。此序列后接着相当多的GT序列。这些序列称为转录终止的修饰点。转录越过修饰点后，mRNA在修饰点被切断，随即加入poly A尾及帽子结构。下游的RNA虽然继续转录，但很快被RNA酶降解。因此有理由相信，帽子结构是保护RNA免受降解的，因为修饰点以后的转录产物无帽子结构。

82．外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。

83．内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。

84．人类最庞大的一个基因是：抗肌萎缩蛋白基因。

85．剪接体：是由snRNP与hnRNA结合，使内含子形成套索并拉近上下游外显子距离的复合体。剪接体是mRNA剪接的场所。剪接过程的化学反应称为二次转酯反应。

86．mRNA编辑：通过对mRNA中的加工，使遗传信息在mRNA水平上发生改变。

87．tRNA的转录后加工：

   （1）tRNA前体的剪接。先由核酸内切酶进行催化进行剪切反应，再由连接酶将外显子连接起来。

   （2）加上3‘端CCA-OH。

   （3）化学修饰。包括：

甲基化反应，使某些嘌呤变成甲基嘌呤。

还原反应，使某些尿嘧啶还原成双氢尿嘧啶（DHU）。

转位反应，尿嘧啶核苷转变为假尿嘧啶核苷（Φ）。

脱氨反应，某些腺苷酸脱氨成为次黄嘌呤核苷酸（I）。

88．rRNA的转录后加工

    （1）rRNA前体的剪接。45S-rRNA经剪接后，分出属于小亚基的18S－rRNA，余下的部分再剪接成5.8S,28S rRNA。rRNA成熟后，就在核仁上装配，与核蛋白体蛋白质一起形成核蛋白体，输出胞浆。

    （2）化学修饰.主要是甲基化反应。

89. 开放阅读框架（ORF）：从mRNA 5‘端起始密码子AUG到3’端终止密码子之间的核苷酸序列，各个三联体密码连续排列编码一个蛋白质多肽链，称为开放阅读框架。

90．遗传密码的特点：

  （1）连续性。编码蛋白质氨基酸序列的各个三联体密码连续阅读。

  （2）简并性。除甲硫氨酸和色氨酸外，其他氨基酸都有2个或多个密码子为之编码，密码子中第三位碱基是可以不同的，这称为密码子的简并性。

  （3）通用性。蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。

  （4）摆动性。反密码与密码之间不严格遵守常见的碱基配对规律，尤其是密码子的第三位碱基对反密码子的第一位碱基，即使不严格配对也能辨认配对，这种现象称为摆动配对。

91．原核生物翻译起始复合物形成：

   （1）核蛋白体亚基分离。核蛋白体大小亚基分离。IF-1,IF-3与小亚基结合，促进大小亚基分离。

   （2）mRNA在小亚基定位结合。原核生物mRNA在小亚基定位涉及两种机制。其一，在各种原核mRNA起始AUG上游约8－13核苷酸部位，存在4－9个核苷酸的一致序列，富含嘌呤碱基如AGGAGG，称为S-D序列。而原核小亚基16S－rRNA的3‘端有一段富含嘧啶的段序列如UCCUCC，通过与S-D序列碱基配对使mRNA与小亚基结合。S-D序列又称核蛋白体结合位点（RBS）。其二，mRNA上紧接S-D序列后的小核苷酸序列可被核蛋白体小亚基蛋白rpS-1识别结合。

   （3）起始氨基酰－tRNA的结合。起始fMet-tRNAifMet和GTP结合的IF-2一起，识别结合对应小亚基P位的mRNA起始密码AUG，起始时A位被IF-1占据，不与任何氨基酰－tRNA结合。

   （4）核蛋白体大亚基结合。上述结合mRNA、fMet-tRNAifMet的小亚基再与核蛋白体大亚基结合，同时IF－2结合的GTP水解释能，促使3种IF释放，形成由完整核蛋白体、mRNA、起始氨基酰－tRNA组成的翻译起始复合物。此时，结合起始密码AUG的fMet-tRNAifMet占据P位，而A位空留，对应mRNA上AUG后的下一组三联体密码，准备相应氨基酰－tRNA的进入。

92．肽链的延长。

  （1）进位。核糖体A位上mRNA密码子所规定的氨酰－tRNA进入核糖体A位上称为进位。这一过程需延长因子EF－T的参与。延长因子有三种：

        1．EF-Tu. 功能：协助氨基酰－tRNA进入核糖体。与氨基酰－tRNA以及GTP结合形成EF-Tu-GTP-氨基酰-tRNA,将氨基酰-tRNA转运到核糖体的A位。

        2．EF-Ts. 功能：促进EF-Tu-GTP的再生。EF-Tu-GTP在参加一轮核糖体循环后转变为EF-Tu-GDP，EF-Ts使EF-Tu-GDP再转变成EF-Tu-GTP，后者可被再利用。

        3．EF-G. 功能：促进肽酰-tRNA移位。促进mRNA-肽酰-tRNA由A位移到P位，促进tRNA的释放。

   (2) 成肽。在转肽酶的催化下，P位上的肽酰基与A位上的氨基酰基成肽，成肽反应在A位进行，卸载的tRNA仍在P位。

  （3）转位。在转位酶的催化下，新生肽链-tRNA连同mRNA从A位移到P位，而卸载的tRNA移入E位。A位空留并对应下一组三联体密码。

93．终止因子：又称释放因子（RF）。其功能是识别mRNA上的终止密码子，终止肽链的合成并释放出肽链。原核生物中释放因子是RF-1,RF-2,RF-3. RF-1识别密码子UAA及UAG，RF-2能识别UAA及UGA。RF-3结合GTP，并能促进RF-1,RF-2与核糖体结合。

94．原核肽链终止过程：肽链延长到mRNA终止密码在核蛋白体A位出现，终止密码子不能被任何氨基酰-tRNA识别进位。RF-1,RF-2进入A位，识别结合终止密码。RF-1或RF-2任一释放因子结合终止密码后都可触发核蛋白体构象改变，诱导转肽酶转变为酯酶活性。使新生肽链与结合在P位的tRNA间酯键水解，将合成的肽链释出。再促使mRNA、卸载tRNA及RF从核蛋白体脱离。RF-3有GTP酶活性，能介导RF-1,RF-2与核蛋白体的相互作用。

95．分子伴侣：分子伴侣是细胞中的一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各功能域和整体蛋白质的正确折叠。细胞中至少有两类分子伴侣家族：热休克蛋白和伴侣素。

96．蛋白质合成后的加工：

  （1）新生肽链的折叠。

  （2）一级结构的修饰。包括：肽链N端的修饰，个别氨基酸的修饰，多肽链的水解修饰。

  （3）空间结构的修饰。包括：亚基聚合，辅基连接，疏水脂链的共价连接。

97．起始因子:

   (1) IF-1.能促进IF-2、IF-3的活化。

(2) IF-2.促进fMet-tRNAifMet与30S小亚基结合的作用，并具有GTP酶活性。

(3) IF-3.功能是使30S亚基从不具活性的核糖体释放，辅助mRNA与小亚基结合，并阻止大小亚基重新聚合。

98．信号假说机制：

这一假说认为，分泌性蛋白初级产物的N-端有信号肽结构。在分泌性蛋白合成中，信号肽一出现，就被信号肽识别粒子与其受体对接蛋白结合，促使膜通道开放，信号肽带动合成中的蛋白质沿通道穿过膜，信号肽在沿通道折回膜内时，被位于膜外侧的信号肽酶切断，使成熟的蛋白质释放到细胞外。

99．抗生素类作用位点：

四环素类：作用于核蛋白体小亚基，抑制氨基酰-tRNA与小亚基结合。

链霉素、卡那霉素：作用与核蛋白体小亚基，改变构象引起读码错误。

氯霉素：作用与核蛋白体大亚基。抑制转肽酶，阻断延长。

红霉素：作用与核蛋白体大亚基。抑制转肽酶，妨碍转位。

放线菌酮：作用与真核核蛋白体大亚基。抑制转肽酶，阻断延长。

嘌呤霉素：作用与真核、原核核蛋白体。属氨基酰-tRNA类似物，进位后引起未成熟肽链脱落。

100．白喉毒素作用机制：

可使真核生物延长因子eEF-2发生ADP糖基化而失活。

     干扰素作用机理：

（1）诱导特异蛋白激酶活化，该活化的激酶使真核主要的起始因子eIF2磷酸化失活，从而抑制病毒蛋白质的合成。

（2）干扰素与双链RNA共同活化2’-5’A合成酶，2’-5’A可活化核酸内切酶RNaseL，后者使病毒mRNA降解，阻断病毒蛋白质合成。

101. 管家基因：有些基因产物对生命全过程都是必不可少的。这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常称为管家基因。管家基因的表达水平受环境因素影响很小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。这类基因表达称为基本（或组成性）基因表达。

102．诱导：可诱导基因在一定环境中表达增强的过程称为诱导。

     阻遏：可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏。

103．基因表达调控的生物学意义：

    （1）适应环境、维持生长和增殖。

    （2）维持个体发育与分化。

104．原核生物转录的影响因素：

    （1）启动子。启动子决定转录的效率和方向。

    （2）σ因子。

    （3）阻遏蛋白具有负调控作用。

    （4）正调控蛋白促进基因的转录。

    （5）倒位蛋白通过DNA重组倒位而调节基因表达。倒位蛋白是一种位点特异性的重组酶。

    （6）RNA聚合酶抑制物可与RNA结合并抑制转录。

    （7）衰减子。

105．衰减子（attenuator）:细菌中mRNA转录和翻译是偶联在一起的。这一特点使细菌中的一些操纵子的特殊序列可以在转录过程中控制转录水平。这些特殊序列称为衰减子。

106．乳糖操纵子

    （1）乳糖操纵子的结构：

含有Z、Y、A三个结构基因，分别编码β－半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶。此外，含有一个操纵基因O，一个启动序列P，一个CAP结合位点和一个基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，与操纵基因O结合。启动序列P、操纵序列O和CAP结合位点组成乳糖操纵子的调控区。

    （2）阻遏蛋白的负性调控作用：

1．当有乳糖存在时，乳糖通过β－半乳糖苷酶变为半乳糖，再经透酶进入细胞内。真正的诱导剂是半乳糖而不是乳糖。乳糖可与阻遏蛋白结合，导致阻遏蛋白与操纵序列O解离，启动基因转录。

2．当没有乳糖存在时，没有诱导剂与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白与操纵序列O结合，发挥负性调控作用，基因不转录。

（3）CAP的正性调控作用：

1．当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时，cAMP和CAP结合紧密，此时CAP结合在CAP结合位点，刺激RNA转录活性。

2．当有葡萄糖存在及cAMP浓度较低时，cAMP和CAP结合受阻，因此lac操纵子表达下降。

（4）协调调节：

     1．当葡萄糖存在，乳糖存在时：尽管乳糖作为诱导剂和阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白与操纵序列O解离。但由于cAMP浓度较低，cAMP和CAP结合受阻，基因处于关闭状态。

     2．当葡萄糖存在，乳糖不存在时：此时无诱导剂存在，阻遏蛋白与DNA结合。而且由于葡萄糖的存在，CAP也不能发挥正性调控作用，基因处于关闭状态。

     3．当葡萄糖和乳糖都不存在时：CAP可以发挥正性调控作用，但由于没有诱导剂，阻遏蛋白的负调控作用使基因仍处于关闭状态。

4．当葡萄糖不存在，乳糖存在时：此时CAP可以发挥正性调控作用，阻遏蛋白由于诱导剂的存在而失去复调控作用，基因被打开，启动转录。

107．色氨酸操纵子调控机制：

        (1)当细胞内色氨酸增多时，结构基因转录受到抑制。衰减子转录物有4段特殊序列。片段1和2，2和3，3和4能配对形成发夹结构，形成发夹能力的强弱依次为片段1/2>片段2/3>片段3/4。片段3/4所形成的发夹结构之后紧接着寡尿嘧啶，是不依赖ρ因子的转录终止信号。

(2)当细胞内有色氨酸存在时，形成色氨酰－tRNA，核糖体编译可通过片段1并通过片段2，核糖体在到达片段3之前就从mRNA脱落。在这种情况下，片段1/2和片段2/3都不能形成发夹结构，只有片段3/4形成发夹结构，即形成转录终止信号，从而导致RNA聚合酶作用停止。

(3)当细胞内没有色氨酸存在时，色氨酰－tRNA缺乏，核糖体停留在两个相邻的色氨酸密码子的位置上，片段1/2不能形成发夹结构，片段2/3之间形成形成发夹结构，则片段3/4之间就不能形成转录终止信号，后面的基因得以转录。

108．SD序列：mRNA起始密码子前的一段富含嘌呤核苷酸的核糖体结合位点。

109．原核翻译水平的调控：

   （1）SD序列是影响翻译的重要因素。

   （2）mRNA的稳定性是调控翻译的方式之一。

   （3）翻译产物也可以对相应mRNA的翻译进行调控。

   （4）小分子RNA可以抑制特定mRNA的翻译。

110．真核生物基因表达在DNA水平的调控主要通过下列几种方式：

   （1）染色质丢失。

   （2）基因扩增。

   （3）基因重排。

   （4）DNA甲基化。

   （5）染色质结构可影响基因表达。

111．反式作用因子：真核细胞内有大量的序列特异的DNA结合蛋白，其中一些蛋白的主要功能是使基因开放或关闭，称为反式作用因子。

112．转录起始复合物形成的步骤：

    （1）TFIID结合TATA盒。

    （2）RNA－pol识别并结合TFIID－DNA复合物。

    （3）其他转录因子与RNA－pol结合，转录起始部位的DNA解链，形成转录起始复合物。

113．反式作用因子的特点：

    （1）一般具有三个功能结构域：DNA结构域、转录活性域和结合其他蛋白的结合域。

    （2）能识别并结合基因调控区中的顺式作用元件。

    （3）对基因表达有正性和负性调控作用，即激活和阻遏基因的表达。

114．锌指结构：是指在结合DNA结构域中含有较多的半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)的区域，借肽链的弯曲使2个Cys 和2个His或4个Cys与一个锌离子络合成的指状结构。

115．同源结构域：许多反式作用因子结合DNA的结构域中有一段相同的保守序列。是由60个左右的氨基酸组成的螺旋－回折－螺旋结构的区域，称为同源结构域。

116．亮氨酸拉链：有些反式作用因子结合DNA结构域中有一段约30个氨基酸组成的核心序列，每隔6个氨基酸有规律的出现1个亮氨酸残基，能形成两性α-螺旋。在螺旋的一侧是排列成行的亮氨酸，具有疏水性，称为亮氨酸拉链区。两个亮氨酸拉链区的单体以疏水作用形成亮氨酸拉链。

117．反式作用因子DNA结合域的结构模式：

 （1）锌指结构。

 （2）同源结构域。

 （3）亮氨酸拉链。

 （4）螺旋－环－螺旋结构。

 （5）碱性α－螺旋。

118．转录活化结构域结构模型：

 （1）酸性α－螺旋结构域

 （2）富含谷氨酰胺结构域

 （3）富含脯氨酸结构域。

119．mRNA的选择性剪接方式

 （1）外显子选择方式可保留或部分保留外显子。

 （2）内含子选择方式可删除或部分删除内含子。

 （3）互斥外显子是指两个外显子不能同时被保留。

 （4）内部剪切位点造成内含子或外显子的部分序列被切除或保留。

120．翻译起始的调控

 （1）阻遏蛋白的调控作用。

 （2）翻译起始因子的功能调控。

 （3）5‘AUG对翻译的调控作用。

 （4）mRNA非编码区长度对翻译的影响。

121．翻译后水平的调控

 （1）新生肽链的水解。

 （2）肽链中氨基酸的共价修饰。

 （3）通过信号肽分拣、运输、定位。

122. 同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。又称基本重组。

123．Holliday模型：

   (1)两个同源染色体DNA排列整齐

   (2)一个DNA的一条链断裂，并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体。

   (3)通过分支移动产生异源双链DNA。

   (4) Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组DNA。即片段重组体和拼接重组体。

124．细菌的基因转移：细菌中，可以通过接合、转化、转导和细胞融合四种方式，在不同DNA分子间发生共价连接，即基因转移。

125．接合作用：当细胞或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA可以从一个细胞（细菌）转移导另一个细胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用。

126．转化作用：通过自动获取或人为的供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是转化作用。

127．转导作用：当病毒从被感染的细胞（供体）释放出来，再次感染另一细胞（受体）时，发生在供体细胞和受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。自然界常见的例子就是噬菌体感染宿主时伴随发生的基因转移。当噬菌体感染宿主时会有两种结局，一是溶菌生长途径，二是溶源菌生长途径。

128．特异位点重组：由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点之间发生的整合称为位点特异的重组。

129．重组DNA常用的工具酶

    1．限制性核酸内切酶：识别特异序列，切割DNA。

   2．DNA连接酶

   3．DNA聚合酶I。具有完整的5’-3’聚合，3’-5’外切活性，以及 5’-3’外切活性。用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解成两个片段，大片段称为Klenow片段。具有5’-3’聚合，3’-5’外切活性，无5’-3’外切活性。

Klenow片段用途：

   （1）在cDNA克隆中，第二股链的合成。

   （2）DNA序列分析。

   （3）补齐双链DNA的3’端。

   （4）通过补齐3’端，使3’端标记。

   4．逆转录酶。

   5．碱性磷酸酶。能去除末端磷酸基。

   6．末端转移酶。在3＇羟基末端进行同聚物加尾。

   7．多聚核苷酸激酶。催化多聚核苷酸5’羟基磷酸化，或标记探针。

130．限制性核酸内切酶：就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

131．回文结构：大部分II类限制性核酸内切酶识别DNA位点的核苷酸序列呈二元旋转对称，通常称这种特殊结构顺序为回文结构。

132．C值 ：基因组的大小常以其DNA含量表示。单倍体基因组中的全部DNA量称为C值。

133．作为克隆载体的质粒应具备：

   （1）分子量相对较小，能在细菌中稳定存在，有较高的拷贝数。

   （2）具有一个以上的遗传标志。

   （3）具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。

134．常用作克隆的载体：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、粘性质粒、病毒载体、酵母人工染色体和细菌人工染色体。

135．DNA克隆：应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体结合成一具有自我复制能力的DNA分子――复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，即DNA克隆。又称基因克隆。实现基因克隆所采用的方法及相关工作称为基因工程或重组DNA技术。

136．基因克隆的步骤：

   （1）目的基因的获取。

     1．化学合成法。

     2．基因组DNA文库。

     3．cDNA文库。

     4．PCR。

   （2）克隆载体的选择和构建。

   （3）外源基因和载体的连接。

     1．粘性末端连接。

     2．平端连接。

     3．同聚物加尾连接。

     4．人工街头连接。

   （4）重组DNA导入受体细胞。

     1．转化：是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主菌，并使其获得新的表型的过程。

     2．感染：λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，然后才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。

3．转染：转染是转化和感染两个词构成的新词，指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。常用方法有：电穿孔法、磷酸钙共沉淀法和脂质体融入法等。

（5）重组体的筛选。

   1．遗传学方法

   2．免疫学方法

   3．核酸杂交法

   4．PCR技术

   5．酶切鉴定

（6）克隆基因的表达

137．真核细胞转染的方法：

（1）磷酸钙共沉淀法

     (2) 电穿孔法

（3）DEAE－葡聚糖法

（4）脂质体介导基因转染

（5）显微注射法

138．重组DNA技术应用

（1）疾病基因的发现和克隆

（2）生物制药

（3）基因诊断

（4）基因治疗

（5）遗传病的预防

139. 细胞间信息物质（第一信使）：凡由细胞分泌的调节靶细胞生命活动的化学物质统称细胞间信息物质。包括：神经递质、内分泌激素、局部化学介质和气体信号。

140．细胞内信息物质：在细胞内传递细胞调控信号的化学物质称为细胞内化学物质。

141．第二信使：通常将Ca2+、cAMP、cGMP、DAG、IP3、Cer、花生四烯酸及其代谢产物这类在细胞内传递信息的小分子化合物称为第二信使。

142．第三信使：负责细胞核内外信息传递的物质称为第三信使。是一类可与靶基因特异序列结合的核蛋白，能调节基因的转录，因此又称为DNA结合蛋白。

143．膜受体分为：环状受体、G蛋白偶联受体、单次跨膜α螺旋受体和具有鸟苷酸环化酶活性的受体。

144．胞内受体包括四个区域：高度可变区、DNA结合区、铰链区和激素结合区。

145．受体与配体结合的特点：高度专一性、高度亲和力、可饱和性、可逆性和特定的作用模式。

146．膜受体介导的信息转导途径

(1)cAMP－蛋白激酶途径。

1．cAMP的生成与降解。一些激素如肾上腺素、胰高血糖素等作用于相应的受体后，活化相应的受体，活化的受体可催化Gs的GDP与GTP交换，导致Gs的α亚基与βγ解离，释放出αs－GTP，αs－GTP可导致AC活化，使得ATP转变为cAMP，细胞内cAMP浓度升高。

  cAMP在细胞内的浓度除与AC活性相关，还和磷酸二酯酶活性有关。

2．cAMP的作用机制。cAMP对细胞的调节作用是通过激活cAMP依赖性蛋白激酶系统来实现的。PKA是一种由四聚体组成的别构酶（C2R2）.其中C为催化亚基，R为调节亚基。每个调节亚基上有两个cAMP结合位点，催化亚基有催化底物蛋白质特定丝/苏氨酸残基磷酸化的功能。调节亚基与催化亚基结合时，PKA呈无活性状态。当4分子cAMP与两分子调节亚基结合后，调节亚基脱落，游离的催化亚基具有蛋白激酶活性。

3．PKA的作用。PKA被cAMP激活后，能在ATP存在的情况下使许多蛋白质特定的丝/苏氨酸残基磷酸化，从而调节细胞的物质代谢和基因表达。

对代谢的调节作用：肾上腺素调节糖原分解的级联反应。肾上腺素与质膜上的受体结合后，通过激动型G蛋白使AC活化，AC激活ATP生成cAMP。后者进一步激活PKA，PKA一方面使无活性的磷酸化酶激酶b磷酸化为有活性的磷酸化酶激酶b，后者能催化磷酸化酶b成为有活性的磷酸化酶a. 磷酸化酶a经磷蛋白磷酸酶脱去磷酸又转变为无活性的磷酸化酶b。磷蛋白磷酸酶活性也受PKA的调节。同时，PKA也使有活性的糖原合酶的特定丝/苏氨酸残基磷酸化转变成无活性。

对基因表达的调节作用:在基因的转录调控区有一类cAMP应答元件（CRE），它可与cAMP应大元件结合蛋白（CREB）相互作用而调节此基因的转录。当PKA的催化亚基进入细胞核后，可催化反式作用因子－CREB中特定的丝/苏氨酸残基磷酸化。磷酸化的CREB与DNA上的CRE结合，从而激活受CRE调控的基因转录。

（2）Ca2+-依赖性蛋白激酶途径

1．Ca2+-磷脂依赖性蛋白激酶途径

IP3和DAG的生物合成和功能：去甲肾上腺素等激素作用于靶细胞膜上相应的受体后，通过Gp激活PI-PLC，后者可水解PIP2而生成DAG和IP3。DAG生成后仍留在质膜上，在磷脂酰丝氨酸和Ca2+的配合下激活PKC。IP3生成后，从膜中扩散到胞浆中与内质网和肌浆网上的受体结合，促进这些钙储存库内Ca2+ 的释放，Ca2+能与胞浆内的PKC结合并聚集到质膜，在DAG和膜磷脂共同诱导下，PKC被激活。

PKC的生理功能：对代谢的调节作用和对基因表达的调节作用。

2．Ca2+-钙调蛋白依赖性途径

钙调蛋白为钙结合蛋白，人体的CaM有4个Ca2+结合位点，这些位点被占满后其构象发生改变。当胞浆内Ca2+浓度高到10-2mmol/L时，Ca2+与CaM结合。Ca2+－CaM底物谱很广，可以磷酸化许多蛋白质的丝/苏氨酸残基，使之激活或失活。Ca2+－CaM既可以激活腺苷酸环化酶又可以激活磷酸二酯酶，使它既加速cAMP的生成又加速cAMP的讲解，使信息迅速传到细胞内，又迅速消失。Ca2+－CaM在细胞的信号传递中也起着重要作用。

（3）cGMP-蛋白激酶系统

cGMP由GTP在鸟苷酸环化酶的催化下生成，经磷酸二酯酶催化而降解。心钠素（ANP）与靶细胞膜上具有鸟苷酸环化酶活性的受体结合后，能激活鸟苷酸环化酶，后者催化GTP转变为cGMP。cGMP能激活cGMP依赖性蛋白激酶G（PKG），催化有关蛋白丝/苏氨酸残基磷酸化，产生生物学效应，即松弛血管平滑肌和增加尿钠，还可以降低血压。

（4）酪氨酸蛋白激酶体系

1．受体型TPK-Ras-MAPK途径：受体与配体结合后，发生自身磷酸化和磷酸化GRB2和SOS。磷酸化的受体与GRB2－SOS复合物结合，进而激活Ras蛋白。Ras蛋白又称小G蛋白，性质类似与G蛋白中的Gα亚基，它的活性和其结合GTP或GDP直接有关，Ras与GDP结合时无活性，与GTP结合而活化。活化的Ras蛋白可进一步活化Raf蛋白。Raf蛋白具有丝/苏氨酸蛋白激酶活性，它可进一步激活有丝分裂原激活蛋白激酶（MAPK）系统。MAPK系统包括MAPK、MAPKK、MAPKKK，MAPK更具广泛的催化活性，它既能催化丝/苏氨酸残基又能催化酪氨酸残基磷酸化，故是具双重催化活性的蛋白激酶。MAPK除调节花生四烯酸代谢和细胞微管形成外，更重要的是可催化细胞核内许多反式作用因子的丝/苏氨酸残基磷酸化，导致基因转录或关闭。受体型TPK活化后还可通过激活AC，多种磷脂酶等发挥调控基因的作用。

2．JAKs-STAT途径

一部分生长因子和大部分细胞因子可借助细胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶JAKs完成信息传导。JAKs再通过激活STAT影响基因的转录调节。

（5）核因子κB途径

主要涉及机体的防御反应、组织损伤和应激、细胞分化和凋亡以及肿瘤生长抑制过程的信息传递。

（6）TGF-β途径

调节增殖、分化、迁移和凋亡等多种细胞反应。

147.双脱氧链终止法测序的基本原理：

和模版互补结合的引物在DNA聚合酶（通常是DNA聚合酶I的大片段Klenow或T7DNA聚合酶）作用下发生互补链的延伸反应，反应体系中的2’-3’-双脱氧链核苷三磷酸(ddNTP)与底物脱氧核苷三磷酸(dNTP)竞争结合与延伸互补链末端，造成延伸终止。由于产生一系列分别终止于A、G、T、C位置的不同大小的DNA末端，应用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳可分辨仅相差一个核苷酸的20－500碱基的DNA片段，结合放射自显影技术，便可直接读出模板DNA的待测序列。

148．化学裂解法测序原理：

采用化学试剂处理末端放射性标记的DNA单链片段，造成碱基非特异性切割，由此产生一组具不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测DNA的核苷酸顺序。

149．大片段DNA序列测定的策略：随机法、嵌套缺失法、引物延伸法。

150．核酸分子杂交：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

151．核酸分子杂交的原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测核酸序列和已知核酸序列。在杂交体系中已知的核酸序列称作探针，探针通常用于进行核素或非核素标记。

152．DNA变性：在物理或化学因素作用下，，可以导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中所有的共价键不受影响，称为DNA变性。

153．导致DNA变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性。

153. Tm值：双链DNA变性一半所需要的温度称作DNA的溶解温度。

154．复性：两条互补的单链DNA分子在变性条件除去后能重新按碱基互补配对原则以氢键相连形成双链DNA分子，这一过程称为DNA复性。

155．影响杂交的因素：

1．核酸分子的浓度和长度

2．温度

3．离子强度

4．杂交液中的甲酰胺

5．核酸分子的复杂性

6．非特异性杂交反应

156．FISH(荧光原位杂交)：是一种非放射性原位杂交方法，用特殊荧光标记核酸探针，可在染色体、细胞和组织切片上进行DNA杂交，能够非常有效地检测细胞内是否存在特定的DNA或RNA序列。

157．Southern Blotting步骤：

1．待测核酸样品的制备。包括制备待测DNA和DNA的限制酶消化。

2．待测DNA样品的电泳分离。

3．凝胶中核酸的变性。

4．Southern转膜。常用的转膜方法：毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法。

5．探针的制备

6．Southern杂交。必须先进行预杂交。

7．杂交结果的检测。

158：预杂交：能够结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。

159．Southern Blotting：是指DNA与DNA的杂交，将电泳分离的待测DNA片段转印并结合与一定的固相支持物上，然后用标记的DNA探针检测待测DNA的一种方法。

160．Northern Blotting:是指将待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固－液相杂交，检测RNA（主要是mRNA）的方法。

161．斑点印迹：将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜上或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点印迹（Dot Blot）.

162. 原位杂交：核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。

163．原位杂交的步骤：

1．组织或细胞的固定

2．组织细胞杂交前的预处理。一般用去垢剂（Triton X－100、SDS）或蛋白酶消化。

3．探针的选择和标记

4．杂交

5．杂交结果检测

164．液相杂交：是指待测核酸分子与核酸探针都存在与杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子，常用的液相杂交有RNA酶保护分析法、核酸酶S1保护分析法。

165．RNA酶保护分析法：是利用RnaseA和RnaseT1能专一性降解单链RNA而双链RNA则受到保护的特点，用放射性标记的RNA探针与待检mRNA进行液相杂交，使互补序列RNA探针和待测RNA形成杂交体。此法用于mRNA定量、mRNA末端定位及确定内含子在相应基因中的位置等。RPA的基本程序：

1．制备待测RNA

2．RNA探针的标记

3．杂交

4．除去单链RNA

5．电泳分析

166．探针的种类：cDNA探针、基因组DNA探针、寡核苷酸探针、RNA探针

167．标记物：

（1）核素标记物：32P、35S等，以32P最常用。

（2）非核素标记物：半抗原、配体、荧光素、化学发光探针。

168．标记方法：缺口平移法、随机引物法、PCR法、末端标记法

169．探针的纯化方法：乙醇沉淀法、Sephadex G-50柱层析法、微柱离心法

170．缺口平移法原理：利用适当浓度的DNaseI在DNA双链上随即切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5’端和一个3’端，3’端即可作为引物，在DNA聚合酶I的5’-3’DNA聚合酶活性催化下，以互补的DNA单链为模版，依次将dNTP结合到切口的3’端，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性在切口处将旧链从5’逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。

171．随机引物法原理：随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物，它们的顺序是根据计算机分析了生物基因组DNA六核苷酸排列的多种可能性而设计的。对于任意一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物都有一些核苷酸片段与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些随机引物与变性后的DNA单链结合，然后以此结合的随机引物为引物，以变性后的单链DNA为模版，在Klenow酶的催化下，以四种dNTP（其中一种为标记物标记的DNA探针）为底物，合成与探针互补的且带有标记物的DNA探针。

172．PCR的原理：

PCR是一种体外扩增DNA的技术，基本原理是：作为引物的一对寡核苷酸与模板DNA同源序列按照碱基互补配对原则形成局部双链，然后在Taq DNA聚合酶作用下引导新链DNA的合成，一般经25－30个变性、退火、延伸的循环，可以获得特异性PCR产物。PCR反应体系包括：耐热的Taq DNA聚合酶、化学合成的寡核苷酸引物、4种dNTP、合适的缓冲液体系、模板DNA。

173．引物设计的原则：

1．引物长度一般为15－30个核苷酸

2．两个引物之间不应该存在互补序列

3．引物本身不应存在互补序列

4．引物与非特异性扩增区序列的同源性不应超过70％，引物的3’端连续8个碱基在待扩增区外不应有互补序列

5．引物的5’端最多可以游离10几个碱基而不影响反应的进行

6．引物碱基组成应随机分布，应避免嘌呤或嘧啶的堆积，特别是引物的3’端不应有连续3个G和C。

7．引物的3’端一定要与模版配对。

174．PCR到达平台期所需PCR循环次数取决于：样品模版的拷贝数、PCR的扩增效率以及DNA聚合酶的种类和活性，以及非特异性产物的竞争。到达平台期前，一般要进行25次以上的循环。

175．PCR反应注意事项：

1．隔离不同操作区，包括样品制备区、PCR操作区和反应产物分析区

2．严格实验操作

3．设立实验对照：阳性对照、阴性对照、试剂对照

176．筑巢PCR：先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用一对内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特异性。

177．多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中不同序列的PCR过程。由于每对引物扩增区位于模板DNA的不同部位，因而扩增片段长短不同。由此检测是否存在某些基因片段的缺失或突变。

178．共享引物PCR：是利用3条引物扩增两种不同的DNA序列，其中一条引物与两种待扩序列都互补，它与另两条引物分别组成两对PCR引物。这种PCR方法常用于细菌学鉴定，确定同一种属细菌的不同种类。

179．原位PCR:以组织固定处理细胞内的DNA或RNA为靶序列，进行PCR反应的过程，称为原位PCR。原位PCR不需从组织细胞中分离模板DNA或RNA。原位PCR成为靶基因序列的细胞定位、组织分布和靶基因表达检测的重要手段。

180．RT－PCR：是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。首先用RNA为模板，在反转录酶作用下合成cDNA，再以cDNA为模版通过PCR反应来扩增目的基因。RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性定量分析的最有效方法之一。

181．实时PCR（Real time PCR）: Real time PCR的基本原理是引入了荧光标记分子，使得在PCR反应中产生的荧光信号与PCR产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，计算出PCR模版DNA的含量。探针的5’端有一个荧光报告分子，3’端有一个荧光淬灭分子。没有扩增反应时，探针保持完整，无荧光信号释放。随着PCR的进行，TaqDNA聚合酶在链延伸过程中遇到与模板结合的荧光探针，其5’-3’外切核酸酶就会将该探针逐步切断，报告荧光基团一旦与淬灭基团分离，便产生荧光信号。后者被荧光检测系统接收，用于数据分析。

182．基因组DNA文库的构建：

基因组DNA文库是指包含某一个生物细胞全部基因组DNA序列的克隆群体，它以DNA片段的形式贮存着某一生物的全部基因组DNA信息。

基因组DNA文库的构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用适当的限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到噬菌体载体中，从而获得一群含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组DNA文库。

183．cDNA文库及构建：

cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。

cDNA文库的构建：将组织细胞中的mRNA经过反转录合成从cDNA，后者被克隆进入质粒或噬菌体载体，转化宿主细胞后可获得克隆群体。

184.转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。

185．导入基因的主要方式：显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法。

186．基因打靶的必备条件：胚胎干细胞、打靶载体

187．打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。

188．基因敲除的基本程序：

1．打靶载体的构建

2．打靶载体导入ES细胞

3．基因敲除ES细胞注射入胚泡

4．胚泡植入假孕小鼠的子宫中

5．嵌合体的杂交育种

189．构建打靶载体的基本过程

1．获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中

2．从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端

3．将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间

4．在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中

190．DNA芯片技术：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为DNA芯片。

191．DNA芯片可分为：原位合成芯片和DNA微集阵列

192．原位合成芯片：采用显微光蚀刻等技术在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片称为原位合成芯片。

193．DNA微集阵列：将预先制备的DNA片段以显微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片称为DNA微集阵列。

194.DNA芯片技术的方法主要包括芯片的制备、样品的制备、分子杂交和检测分析。

195．原位合成芯片是采用显微光蚀刻或压电打印技术。

196．DNA芯片技术的应用：DNA序列测定、基因表达分析、基因组研究、基因诊断、药物研究与开发

197．癌基因：是细胞内控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性。癌基因表达异常时，其产物可使细胞无限制分裂。癌基因包括细胞癌基因和病毒癌基因。

198．原癌基因：正常细胞内未被激活的癌基因称为原癌基因。

199．病毒癌基因与细胞癌基因的比较：

相同之处：两者结构十分相似、序列上存在一定程度同源性、产物也基本相似。

不同之处：

1．病毒癌基因与细胞癌基因相比，通常丢失了两端的某些序列。

2．病毒癌基因没有内含子，而细胞癌基因中通常含有内含子或插入序列。

3．病毒癌基因与同源的细胞原癌基因在外显子序列中也有微小的差别。

4．病毒癌基因常会出现碱基取代或碱基缺失等突变，而细胞癌基因则较少发现这一类病变。

200．癌基因家族包括：src家族、ras家族、myc家族、sis家族、erb家族

201．抑癌基因：是指存在于正常细胞中的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当这类基因发生突变、缺失或失活时可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。

201．癌基因表达产物：

1．细胞外的生长因子

包括生长因子、激素、神经递质、药物等

2．跨膜的生长因子受体

3．核内转录因子

4．非受体酪氨酸蛋白激酶

5．G蛋白

202．癌基因的活化机制：

1．点突变

2．基因重排

3．原癌基因扩增

4．获得启动子与增强子

5．染色体易位

203．基因诊断常用的技术

1. 核酸分子杂交

2．PCR

3．DNA序列测定

4．DNA芯片技术

5．限制酶酶谱分析

6．单链构象多态性检测

204．单链构象多态性（SSCP）：DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象。相同长度的单链DNA，如果碱基组成和(或)排列顺序不同，形成的构象就不同，这就形成了单链构象多态性。

205.基因诊断的应用

1．对遗传病的防治

2．对肿瘤进行诊断

3．感染性疾病的基因诊断

4．传染性疾病的诊断

5．对重大疾病易感性的诊断

6．器官移植配型

7．法医学的应用

206．基因诊断的特点

1．以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。

2．分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，具有很高特异性。

3．由于分子杂交和PCR技术都具有放大效应，故诊断灵敏度很高

4．适用性强，诊断范围广。

207．限制酶酶谱分析

此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的突变，则其限制酶酶切片段的大小或多少在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。

208．DNA限制性片段长度多态性（RFLP）

不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。

209．等位基因特异寡核苷酸探针（ASO）杂交法

根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针，一种是相应于突变基因碱基序列的寡核苷酸(M)，一种是相应于正常基因碱基序列的寡核苷酸(N)，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交。若受检者DNA能与M杂交，而不能与N杂交，说明受检者是这种突变的纯合子；若受检者DNA既能和M杂交也能和N杂交，说明受检者是这种突变的杂合子；若受检者不能与M杂交，但能与N杂交，说明受检者不存在这种突变基因；如果受检者和M、N均不结合，说明缺陷基因可能是一种新的突变类型。

210.基因治疗的方法:

1. 基因矫正：将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留

2．基因置换：用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。

3．基因增补：将目的基因导入病变细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物补偿缺陷基因的功能或使原有的功能得到增强。

4．基因失活：是将特定的序列导入细胞后，在转录、翻译水平阻断某些基因的异常表达，以达到治疗疾病的目的。包括反义RNA技术、核酶、三链技术和干扰RNA技术。

211．基因治疗的基本程序：

1．治疗性基因的选择

2．基因载体的选择

3．靶细胞的选择

4．基因转移

5．外源基因表达的筛检

6．回输体内

212．单核苷酸多态性(SNP):是指出现在基因组DNA分子的特定位置的单个核苷酸的置换。

213．RNAi（RNA干涉）：是指由短双链DNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因的表达受到抑制。

214．RNA干涉原理、步骤和应用：

原理：双链RNA 激活Dicer（ 酶复合物，由核酸内切酶和解旋酶组成），识别异常的双链RNA并将其切割成短双链RNA（siRNA，21-23bp）， siRNA与Dicer结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），双链RNA经解旋酶作用，成为单链RNA，识别并结合靶RNA分子，致核酸内切酶的切割，失去编码蛋白质的功能。

步骤：1．长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶切成21－23个碱基对的短双链RNA，称为小干涉性RNA(siRNA)。

2．siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断。

应用：功能基因组学、微生物学、基因治疗如病毒性疾病的治疗、遗传性疾病的治疗、肿瘤病的治疗。