易基因｜动物发育：DNA甲基化组与转录组综合分析绒山羊胚胎期毛囊发育的调控机制

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西北农林科技大学动物科技学院博士研究生王善禾和李芳为共同第一作者、王昕教授和榆林学院屈雷教授为共同通讯作者以“Integrative Analysis of Methylome and Transcriptome Reveals the Regulatory Mechanisms of Hair Follic”为题在《Cells》杂志上发表研究论文，通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和对应的转录组测序（RNA-seq）联合分析揭示了陕北绒山羊早期毛囊形态发生的调控机制。

标题：Integrative Analysis of Methylome and Transcriptome Reveals the Regulatory Mechanisms of Hair Follic（甲基化组和转录组的综合分析揭示了绒山羊毛囊形态发生的调控机制）

时间：2020.04.14

期刊：Cells

影响因子：IF 7.666

技术平台：WGBS、RNA-seq

样本：陕北绒山羊胚胎期65天（E65）和120天(E120)皮肤组织，各3个样本，共6个

实验：WGBS、RNA-seq、甲基化组与转录组关联分析、染色实验、实验验证（qRT-PCR、半定量RT-qPCR、BSP）

摘要：

先前对人和小鼠的研究表明，毛囊形态发生依赖于紧密协调的外胚层-中胚层互作，包括多种信号和调控因子。DNA甲基化和长链非编码RNA（lncRNA）通过调控基因表达在早期胚胎皮肤发育中起关键作用。lncRNA作为一种间接调控因子，可以将DNA甲基转移酶招募到特定的基因组位点，从而导致DNA甲基化。然而绒山羊毛囊形态发生的分子调控机制尚不清楚。

为揭示绒山羊胚胎期毛囊形态发生的复杂调控过程，本研究采用RNA-seq测序分析和全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术对绒山羊胚胎期第65天（E65）和第120天（E120）的皮肤组织进行研究分析。RNA-seq、qRT-PCR和免疫组化结果表明，Wnt信号在毛囊诱导和分化阶段都起重要作用；转录因子（TFs），包括HOXC13、SOX9、SOX21、JUNB、LHX2、VDR和GATA3，通过在E120的特异性表达参与毛囊分化。随后，WGBS和RNA-seq关联分析表明，一些毛囊分化基因和TF基因的表达与DNA甲基化水平总体呈负相关。部分毛囊分化基因在毛囊诱导阶段被甲基化和抑制，但随后在毛囊分化阶段被去甲基化和表达，表明DNA甲基化通过调控相关基因表达在毛发形态发生中起重要作用。此外，通过lncRNA图谱鉴定出E120与E65中45个上调和147个下调lncRNA，揭示了与靶基因DNA甲基化相关的潜在差异表达lncRNA。总之，在绒山羊毛囊形态发生过程中揭示了关键信号和基因。此过程中，与毛囊诱导阶段相比，毛囊分化过程中的DNA甲基化水平较低，可能通过调控相关基因表达在毛发形态发生中发挥重要作用。另外，本还描述了与靶基因上DNA甲基化相关的潜在lncRNA，丰富了毛发形态发生的调控网络和分子机制。

结果图形

（1）绒山羊毛囊诱导与分化阶段的形态研究

 图1：陕北绒山羊胚胎E65和E120在毛囊发育过程中的皮肤形态

（2）毛囊诱导和分化的不同分子特征

图2：RNA-seq 揭示了毛囊诱导和分化过程的差异表达基因(DEGs)和关键信号通路。

（a）RNA-seq样品准备的工作流程；

（b）E65和E120之间的DEGs热图。

（c）E65和E120 之间的DEG的KEGG通路图。

图3：毛囊诱导和分化差异表达基因验证

图4：免疫组化（IHC）验证羊绒皮肤组织上Pc和DC细胞的特异性基因。

（3）毛囊诱导和分化过程中的Wnt信号

图5：IHC检测毛囊诱导期和分化期β-连环蛋白、WLS和FZD10表达

（4）皮肤毛囊发育的LncRNA分析

图6：绒山羊E65和E120皮肤组织的lncRNA鉴定和特征描述

图7：LncRNA在不同时期的表达模式。结果与 RNA-seq 数据一致。

（5）形态发生过程中毛发诱导和分化的基因组DNA甲基化

图8：mCG、mCHH和mCHG不同基因区域的甲基化水平。在全基因组范围内，E65在所有区域均表现出较高的CG甲基化状态。在转录起始位点周围的区域观察到明显的低甲基化。

图9：E65和E120之间差异甲基化基因的热图和KEGG通路图。共鉴定出3371个差异甲基化基因（DMG），KEGG分析显示DMG在TGF-β富集。

1. E65和E120之间差异甲基化基因的热图。
2. E65和E120之间差异甲基化基因的KEGG通路。

（6）WGBS和mRNA-seq数据关联分析

图10：E65和E120之间的差异甲基化基因和差异表达基因之间的维恩图。与E65相比，547个低甲基化基因在E120中高表达，而282个高甲基化基因2在E120中低表达。

图11：差异甲基化基因及其表达验证。BSP（Bisulfite Sequencing Polymerase Chain Reaction）检测的DNA甲基化与WGBS结果一致，基因表达结果与RNA-seq一致，其中基因表达受高DNA甲基化抑制。

结论：

本研究利用全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和转录组测序（RNA-seq）技术，对早期胚胎皮肤发育的调控机制进行了研究，发现Wnt信号通路在毛囊诱导和分化过程中发挥重要作用，HOXC13, SOX9, SOX21, JUNB, LHX2, VDR 和 GATA3等转录因子在胚胎期120天特异性表达参与毛囊分化。说明DNA甲基化能够通过影响基因的表达在毛囊形态发生中发挥重要作用。与此同时，发现lnc-00205，lnc-007623和lnc-000374在胚胎期120天特异性表达，此时它们的靶基因处于高度甲基化，这一结果表明一些关键的差异lncRNA通过调控靶基因的甲基化而在绒山羊皮肤毛囊早期发育中发挥重要作用。该研究揭示了lncRNA和DNA甲基化在调控陕北绒山羊毛囊形态发生中的重要作用，丰富了毛囊形态发生的调控网络和分子机制。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）技术

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
• 小规模研究课题

技术优势：

• 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
• 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
• 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，技术详情了解请致电易基因。

参考文献：

Wang S, Li F, Liu J, Zhang Y, Zheng Y, Ge W, Qu L, Wang X. Integrative Analysis of Methylome and Transcriptome Reveals the Regulatory Mechanisms of Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goat. Cells. 2020 Apr 14;9(4) pii: cells9040969.

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