单细胞测序学习笔记（二）——细胞注释

1.细胞鉴别 

在上一步对各类细胞进行featureblot后，可以根据文献或者在线数据库来对细胞进行鉴别。此处我使用的是CellMarker网站。

 

对照起来进行鉴别，但是有些细胞簇有两个marker，有些细胞簇的marker有重合，所以鉴别这一步具有比较大的主观性，需要结合多个数据库或者文献进行判断。

在完成鉴别后，创建一个新的字符向量保存细胞名称，顺序从0-12一一对应。

以下是我自己的判断结果：

new.cluster.ids <- c("Memory T cell","CD14+ Mono", "CD8 T",
+ "NK", "CD8 T", "B", "B", "undefined", "Cytotoxic T", "NK","DC",
+"Megakaryocyte progenitor cell","CD1C+_B dendritic cell")

接下来，使用names()函数，将pbmc的levels和new.cluster.ids一一对应。

names<- 是通用替换函数。The default methods get and set the "names" attribute of a vector (including a list) or pairlist.用levels中的字符向量设置new.cluster.ids的names属性。

如果levels()比names()短，则会以NA填充names()。

names(new.cluster.ids) <- levels(pbmc)
> new.cluster.ids
                              0                               1                               2 
                "Memory T cell"                    "CD14+ Mono"                         "CD8 T" 
                              3                               4                               5 
                           "NK"                         "CD8 T"                             "B" 
                              6                               7                               8 
                            "B"                     "undefined"                   "Cytotoxic T" 
                              9                              10                              11 
                           "NK"                            "DC" "Megakaryocyte progenitor cell" 
                             12 
       "CD1C+_B dendritic cell" 

可以看到对应关系

然后给pbmc中每个identity重命名

再次查看UMAP聚类图

DimPlot(pbmc, reduction = "umap", label = TRUE, pt.size = 0.5) + NoLegend()

 设置NoLegend()，因为已经将名称添加到图上。

然后保存这一步结果

saveRDS(pbmc, file = "pbmc_final.rds")

关于save和saveRDS，参考R语言 save与saveRDS - JoAnna_L - 博客园：

Rda与Rdata，前者是后者格式的缩写，在R里加载同样使用load()。

save与saveRDS的区别在于，前者保存的数据文件格式为.Rda或Rdata，读入R使用load()，载入的数据名称为原数据名称，不可指定。

后者保存的数据文件格式为.rds，读入使用readRDS，读入的数据名称可指定：name<-readRDS('.rds')。因此当保存单个对象时，推荐使用后者。

save不仅可以保存数据，也可保存模型结果、函数等，可保存至.R文件中。

2. 使用SingleR进行注释

SingleR是针对scRNAseq的一种注释工具，给出具有已知标签的样本(single-cell or bulk)的参考数据集，它基于与参考集的相似性来标记来自测试数据集的新的细胞。

首先调用一下需要的包，这里用了pacman包调用

p_load(SingleR,reshape2,celldex)

 接下来把pbmc的聚类结果单独储存为meta对象

meta <- [email protected]

 获取标准化矩阵

关于GetAssayData()的用法# Get the data directly from an Assay object
GetAssayData(pbmc_small[["RNA"]], slot = "data")[1:5,1:5]

这一步是从Seurat对象的data槽中访问数据

pbmc_for_SingleR <- GetAssayData(pbmc, slot="data")

参考seurat对象结构 - 简书：使用GetAssayData函数可以从Seurat对象访问数据。

可以使用SetAssayData将数据添加到counts，data或scale.data插槽中。新数据必须具有与当前数据相同顺序的相同细胞。添加到counts'或data`中的数据必须具有与当前数据相同的features。

下一步，使用SingleR里celldex的HumanPrimaryCellAtlasData对pbmc_for_SingleR里的数据进行注释，加上label

问题：

由于SingleR的数据库是通过ExperimentHub服务器下载的，大陆网络无法连接，会报错如下：

Cannot connect to ExperimentHub server, using 'localHub=TRUE' instead
Error in .updateHubDB(hub_bfc, .class, url, proxy, localHub) : 
  Invalid Cache: sqlite file
  Hub has not been added to cache
  Run again with 'localHub=FALSE'

在此处使用SingleR的解决方法参考了jimmy老师推荐的第二种方法：singleR的7个数据库文件下载失败的解决方案 - 云+社区 - 腾讯云

下载《生信会客厅》上传的数据库文件

链接：https://pan.baidu.com/s/13EjK-66tZKRsSl9G80S7uw 
提取码：8mfb

下载完成后里面有SingleR里的7个数据库的数据集合，我们在这里要用的 HumanPrimaryCellAtlasData在ref_Human_all的R.data文件当中

读取文件

pbmc.hesc <- SingleR(test = pbmc_for_SingleR, ref = refdata, 
+ labels = refdata$label.main) 

 这里labels选项有label.main和label.fine，main大类注释，也可使用fine小类注释，不过小类注释准确性不好确定。

然后查看新注释的标签与seurat分类的结果的交叠情况

> table(pbmc.hesc[["labels"]],meta$seurat_clusters) 
                  
                      0    1    2    3    4    5    6    7    8    9   10   11   12
  B_cell              0    0    0    0    0  264  265    0    0    0    0    0    2
  CMP                 0    0    0    3    0    0    0    0    0    0    0    0    0
  GMP                 0    0    0    0    0    0    0    0    0    0    0    0    1
  Monocyte            2  922    0    0    0    1    0    0    0  104   51    0   12
  NK_cell             0    0    1  327   46    0    1    3    0    0    0    0    0
  Platelets           0    0    0    0    0    0    0    0    0    0    0   28    0
  Pre-B_cell_CD34-    2    4    0    0    0    0    0    0    0    1    0    0   11
  T_cells          1278    1  740    3  273    5    2  120  122    0    0    0    0

可以看出来跟我自己的主观判断还是有所出入的

然后将注释后的结果做热图并保存为pdf

> pdf("plotScoreHeatmap.pdf")
> print(plotScoreHeatmap(pbmc.hesc))
> dev.off()

 这样做出来的图比较漂亮和直观，能看到T细胞占了pbmc中大部分，其次是单核细胞

向pbmc_fianl的meda.data数据中加上pbmc.hesc的label（中间在运行的时候R关闭过一次，之后拿pbmc_final继续的分析，后续代码应该是pbmc的地方都换为pbmc_final）

[email protected]$labels <-pbmc.hesc$labels

继续绘制DimPlot的对比图

print(DimPlot(pbmc_final, group.by = c("seurat_clusters", "labels"),
+ reduction = "umap", label = T))

 （这里右图label叠在一起了，除了用label.size缩小label字号以外还可以怎么修改）

更加美观的绘图方法如下：

> aa=table(pbmc.hesc[["labels"]],meta$seurat_clusters)

将labels信息和cluster信息合为列表存为aa

aa= apply(aa,2,function(x) x/sum(x))

将aa值设置为百分比，apply()函数中2表示对aa中的数据按列（cell clusters）处理

df=as.data.frame(melt(aa))

将aa转化为数据框

df$Var2=as.factor(df$Var2)

把df中的Var2变量转化为因子（按照整数向量的形式储存类别值）

 

 使用ggplot2绘制气泡图（上一步把Var2转化为因子）

> library(ggplot2)
> g <- ggplot(df, aes(Var2, Var1)) + geom_point(aes(size = value), colour = "green") + theme_bw() 
> g

 绘制热图

> library(pheatmap)
> pdf("heatmap.pdf",height=5,width=10)
> heatmap <- pheatmap(log2(aa+10), color=colorRampPalette(c("white", "blue"))(101))
> print(heatmap)
> dev.off()