非因解读 | RPPA技术助力前列腺癌血清来源细胞外囊泡中癌症标志物研究
前列腺癌(PCa)仍然是目前发达国家男性癌症相关疾病死亡的第二大原因，相当一部分前列腺癌患者被诊断为晚期，而其他患者保留惰性肿瘤不会发展为侵袭期。因此，准确的早期诊断有可能改善前列腺癌患者的预后和生活质量，同时能有效减少患者的过度治疗。
意大利罗马高等卫生研究院的Michele Signore研究团队于2021年7月，在《Cell Death and Disease》(IF:5.959 )杂志上发表题为“Diagnostic and prognostic potential of the proteomic profiling of serum-derived extracellular vesicles in prostate cancer”的文章（图1），利用反相蛋白微阵列(RPPA)技术，来定量从前列腺癌患者血清中分离的细胞外囊泡（EVs）的关键抗原和激活信号强度，EVs的蛋白质组学分析与常规临床指标相结合可能有助于早期癌症检测，具有临床价值的预后意义。
RPPA是一种基于平面微阵列和免疫反应的高通量高内涵靶向蛋白组学技术。非因RPPA靶向蛋白组学技术可实现上千例样本300-500种关键蛋白靶点的平行分析，包括大量细胞信号蛋白、免疫通路蛋白、蛋白修饰（磷酸化，乙酰基化，甲基化）等，可根据需求实现靶点个性化定制。每个样本仅需15毫克组织或40微克总蛋白。
图1
研究亮点
通过反相蛋白质微阵列（RPPA）技术，研究团队评估了从PCa肿瘤患者、健康献血者、肥大性疾病患者和前列腺切除术后无疾病患者的血清中分离的EVs的蛋白质组学数据。并进一步纳入到15年随访的回顾性队列，以确定筛选到的生物标志物的预后价值。最后，作者主张将反相蛋白质微阵列（RPPA）和基于EVs的液体活检相结合的检测手段作为非侵入性癌症监测工具，进而纳入PCa的个性化治疗中。
研究思路
研究结果
1. RPPA可检测到细胞系中微量磷酸化蛋白EGFR_pY1068的表达
研究者通过差速超速离心分离细胞系中EVs。通过扫描和透射电子显微镜（分别为SEM和TEM）进行分析，90%EVs的直径范围落在34-100 nm区间（图2A，B）。RPPA和Western分析表明，这些分离的EVs表达了通常在外泌体中富集的跨膜和胞质蛋白。Western和TEM免疫金标记证实，从H1975和H1299分离的EVs与其母细胞中上皮细胞粘附分子（EpCAM）的表达一致（图2C）。
图2
研究者进一步利用RPPA检测EVs跨膜蛋白的翻译后修饰活化水平，例如磷酸化。为此评估了上皮生长因子受体（EGFR）及其一种磷酸化形式（EGFR_pY1068）在A431（上皮鳞癌细胞系）和CAF（PCa相关成纤维细胞）中的表达。从培养基中分离EVs，并混合成比例进行RPPA分析，发现EGFR_pY1068可检测到低至皮克级别的表达量（图3）。尽管敏感性和特异性可能取决于一抗性能和抗原相对表达，但数据也充分表明RPPA检测EVs的方法是可行且稳健的。
图3
2. RPPA可检测NSCLC和CRC样本血清EVs中低至皮克水平的EGFR_pY1068
为了验证RPPA结果，研究者创建一种自制的ELISA（酶联免疫吸附试验），EVs被直接涂覆到酶标板上，随后通过比色检测来探测不同表面标记物的表达（图4A）。ELEXO测量了从H1975和H1299分离的EVs上的EpCAM和外泌体marker CD81，数据显示EpCAM水平仅在H1975提取的EVs中可显著检测（图4B）。由于H1975和H1299细胞均表达PD-L1，研究者使用ELEXO确认其分泌的EVs上存在PD-L1，并通过RPPA分析，获得了类似的结果。
对7份结肠腺癌（CRC）以及6份晚期非小细胞肺癌（NSCLC）血清样本提取的EVs，通过SEM和TEM分析，大多数EVs（85%）的直径在34到100 nm之间（图4C-E），使用ELEXO检测CRC样本EVs中的EpCAM水平以及NSCLC样本EVs中的PD-L1水平，证实ELEXO的临床适用性（图4F-G）。通过RPPA检测原发性NSCLC和CRC样本（n=35）血清分离的EVs中EGFR_pY1068水平，EGFR_pY1068在皮克水平下仍能检测到（图4H）。
图4
3. 利用RPPA检测PCa患者EVs蛋白质组中差异表达靶点
受以上实验结果启发，研究者对“关键组别”的患者样本进行了RPPA实验，这些患者仅由PCa患者和健康个体（HD）组成（图5A），发现使用37种蛋白对血清EVs进行分析即足以区分样本类型（图5B）。特别是ERG（ETS相关基因）、PD-L1、Survivin、Integrin-β5、IL-6和SPARC在肿瘤EVs中发生了显著改变（图5D）。对关键EVs（磷酸化）蛋白的RPPA分析，如EGFR、mTOR和VEGFR途径相关蛋白，可帮助癌症患者采用特定的靶向治疗策略（图5E，F）。
图5
4. 利用RPPA发现PCa患者血清EVs中特异性生物标记物
研究者分析了一组规模更大的患者集，包括：健康供体（HD）、12个月以上无病患者（DF）、肥大病例（Hyper）和肿瘤（PCa）。RPPA靶点相对于关键组别进一步扩大，为了更好地确定关键疾病特异性标记物，将PCa与其他各组（即Hyper、DF或HD）进行比较，发现显著不同的抗原（图6A）。根据PCa与对照组（分为HD组和Hyper组）的ROC曲线分析中的个体表现，phospho-c-Myc_T58/S62和phospho-TSC2_Y1571成为最佳诊断指标（图6B）。与对照组相比，至少一半的PCa具有较低phospho-c-Myc_T58/S62和较高的phospho-TSC2_Y1571（图6C）。
图6
5. RPPA数据证实了基于EVs的蛋白质信号具有临床价值的预后意义
为了确定预测进展风险的生物标志物，研究者利用一个回顾性队列（图5A），将患有晚期肿瘤的高危患者分组与低/中危患者进行比较（图7A）。调查了RPPA抗原水平与回顾性队列（即风险评估）中复发频率之间的相关性，RPPA热图显示，与复发病例和晚期肿瘤病例相比，非复发病例聚合为一个单独的集群（图7B），支持这种分析方法的潜在预后影响。同时，观察到ERG蛋白的过度表达超出了各组类别的临界值（图7C），复发患者中ERG蛋白表达升高与转录组数据相一致，证实ERG过度表达与基因组融合平行，并通过激活WNT和MAPK信号促进PCa进展。
图7
研究总结
迄今为止，PSA血液筛查是PCa诊断的一种无创检测方法，但该方法发现PCa的几率仅为30–40%。EVs作为癌症生物标记物的重要来源，其蛋白质组分析可能提供有价值的诊断策略，以补充当前液体活检技术的不足。
本文研究者使用RPPA平台对癌症患者血液EVs中的蛋白质进行RPPA高通量分析，其数据结果可提高早期诊断的准确性和可行性，而基于EVs的蛋白质组学分析与其他可用的临床和转录组数据的整合可能会推动下一代多参数液体活检分析技术的诞生，从而为PCa和其他癌症的风险评估、筛查、诊断和治疗提供新的工具。