非因解读 | RPPA蛋白组学平台助力慢性淋巴细胞白血病不同表观遗传特征的识别

RPPA蛋白组学平台助力慢性淋巴细胞白血病不同表观遗传特征的识别

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是最常见的血液系统恶性肿瘤，其特征是在骨髓、外周血、脾脏和其他淋巴器官出现大量B 淋巴细胞的恶性增殖。目前慢性淋巴细胞白血病治疗方法已经有了很大的进展，新疗法能够显著改善患者的预后结果，但CLL 患者的临床是复杂多变的，大多数先前公认的预后特征缺乏预测现代治疗反应的能力，所以需要找到新的预后标志物。

为评估表观遗传图谱是否具有评价预后或治疗潜力的能力，2021年10月MD安德森肿瘤研究中心联合格罗宁根大学医学中心和莫尔豪斯医学院等研究机构在《Leukemia》（IF：11.528）杂志上发表题为“RPPA-based proteomics recognizes distinct epigenetic signatures in chronic lymphocytic leukemia with clinical consequences”的研究性论文（图1）。本文中，作者使用反相蛋白微阵列技术（RPPA）对CLL和相关疾病患者的样本（n=871）进行384个蛋白靶标的全景分析，其中包括组蛋白修饰酶和组蛋白翻译后修饰（包括甲基化、磷酸化、泛素化等），通过分析这些调控表观修饰的蛋白，作者发现基于蛋白质组学的表观遗传生物标志物可用于更好地对 CLL 患者进行分类并提供治疗指导。

RPPA是一种基于平面微阵列和免疫反应的高通量、高内涵靶向蛋白组学技术。非因RPPA靶向蛋白组学技术可实现上千例样本300-500种关键蛋白靶点的平行分析，包括大量细胞信号蛋白、免疫通路蛋白、蛋白翻译后修饰（磷酸化，乙酰基化，甲基化）等，并可根据需求实现靶点个性化定制。每个样本仅需15毫克组织或40微克总蛋白。

图1

研究背景

表观遗传是指基因序列没有改变的情况下基因表达发生稳定并可遗传的改变，包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等。遗传、环境或代谢损伤都可能引起表观遗传改变，从而激活原癌基因并调控细胞状态，因此肿瘤的发生和发展不仅是遗传突变也是表观遗传改变的结果。DNA甲基化和组蛋白修饰，对CLL的发生、发展和预后起到重要作用，CLL 细胞的起源可以通过表观遗传标志物进行追踪。作者为了评估表观遗传图谱是否具有评价预后或治疗潜力的能力，使用RPPA技术重点对染色质修饰酶 (HME) 和组蛋白甲基化标记 (HMM) 蛋白进行分析，来识别 CLL的表观遗传特征。

研究思路

研究结果

1.CLL中四种表观遗传指导的蛋白质组学特征分析

通过对871例样本中37种表观遗传相关蛋白进行聚类分析发现，患者被完美地分为四种表观遗传蛋白质组学特征（epigenetic proteomic signatures，ProSig）。与正常B 淋巴细胞相比，ProSig 共同表现出 泛素化HIST1H2B、hnRNPK、H3K4me3、HDAC1 H2AX.pSer140 、JMJD6蛋白的低表达特征。ProSig1（粉红色）的特点是大多数HME和HMM的表达较低 ，但 PAK1 、EZH2、DNMT1、HDAC6 相对高表达。ProSig2（黄色）的特征是大多数 HMM 的表达水平较低，而PAK1、ASH2L、KAT2A、BRD4、EZH2、DNMT1 和 HDAC6表达水平较高。ProSig3（绿色）中的患者与其他患者相比较表现出CBX7 和 HMM高表达的特征（图2 A）。

图2

2. 表观蛋白遗传组学特征与每个治疗方案的生存期和第二次治疗概率相关

为了探究表观遗传蛋白质组学特征是否对新旧治疗方案都有预后评估作用，作者分析了四个表观遗传组学特征组中的患者经过第一次各种不同治疗方法（化疗、BTKi 和抗体/靶向治疗）后的总生存期 (OS-post-Tx) 和到第二次治疗的持续时间 (TTST) 。值得注意的是，与BTKi治疗相比，ProSig1基于化疗的两项指标os - post- Tx时间更长，但总体仍比其他特征组短（图3 A)。低HME和高HME的ProSig4患者在抗体/靶向治疗后都会在较短时间内进行第二次治疗。同时观察到 ProSig1 中的患者经BTKi 治疗后OS-post-Tx最短（图3 B）。与 ProSig3 相比，ProSig2 在化疗后的 OS-post-Tx 较短，但与 BTKi 疗法表现相似。同样在靶向治疗中ProSig2 的OS-post-Tx 和TTST略逊于 ProSig3（图3 C）。因此低HMM与化疗治疗后的不良预后有关，但与BTK抑制剂治疗后的不良预后无关。

图3

3.筛选差异性蛋白作为CLL预后的标志物

为了在不同的特征组之间寻找可以预测CLL预后的蛋白标志物,作者分析了Prosig1-4中的差异蛋白（CD19+为基准）。发现ProSig1 以低 MEN1、KMT2A 和 SETD1A，高 HDAC6 和 EZH2为代表（图 4A-E）。ProSig4 是唯一一个相对于 CD19+具有相对较低 ASH2L 和 DNMT1 的集群。ProSig1 和 4 具有相反的预后影响，ProSig1 和 4 主要通过 H3K4me1-2、H3K27me3 和 H3K36me3（图 4I-K）的 表达来区分，这表明了这几种甲基化修饰蛋白潜在的重要性。在所有四个 ProSig 中，HMM 表达和预后都从 ProSig 1 依次增加至 2、3 和 4（图 4I-K），除了在 ProSig4 中最低的 H3K9me2（图 4L）。接下来作者通过Cox比例风险模型来确定在整个CLL队列中具有显著预测价值的相关蛋白，发现 H3K36me3 和 H3K27me3 可作为成为 OS、TTFT 和 TTST 的预后标志物。

图4

4.基于表观遗传特征的功能失调蛋白质网络

作者使用 Cytoscape 可视化384 个靶点的蛋白质网络，用于识别相关蛋白质网络中的差异（图5），并且可以更全面地展现在四个表观遗传特征组中 HMM/HME（大节点）以及其他相关靶点（小节点）之间的变化。揭示了在整个表观遗传组学特征中的四个表观特征组的整体相关变化，在蛋白功能网络层面上为揭示CLL疾病进程提供了依据。

图5

研究结论

本研究的新颖之处在于通过RPPA技术在蛋白质组水平上同时分析组蛋白甲基化和染色质修饰蛋白，首次展示了HME和HMM在 CLL 中的不同表达模式，并且这些模式与患者临床特征和治疗预后显著相关，充分说明RPPA中包含的表观遗传学相关蛋白及翻译后修饰蛋白可以作为临床分型及新型标志物的筛选提供强有力的分析工具。