GEO数据挖掘（学习笔记）

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生信菜鸟一枚，记录下学习生信技能树GEO数据挖掘相关视频的学习笔记。

1. GEO数据库简介

NCBI Gene Expression Omnibus（GEO）是一个存储各种高通量实验数据的公共数据库。这些数据包括基于单通道和双通道微阵列的实验，检测mRNA，基因组DNA和蛋白质丰度，以及非阵列技术，如基因表达系列分析（SAGE），质谱蛋白质组学数据和高通量测序数据。网址如下：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/

2. 数据下载

gset是一个列表，里面拥有表达矩阵、分组信息、临床资料等等内容，

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# GEO accession : GSE42872
# Platforms     : GPL6244
# BioProject    : PRJNA183688
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#####数据下载#####
if(!require(GEOquery)) BiocManager::install("GEOquery") # 安装包
package.version("GEOquery") # 查看版本
help(package = "GEOquery") # 查看GEOquery中的函数
library(GEOquery) # 加载包
library(tidyverse)
search() # 查看已加载R包
gset <- getGEO('GSE42872',destdir = ".",
               AnnotGPL = F,getGPL = F)#下载GSE数据
save(gset,file = 'GSE42872.gset.Rdata')
# 读入表达矩阵，这里提供两种方法
exprset <- data.frame(exprs(gset[[1]])) # 推荐
exprset <- read.table(file = 'GSE42872_series_matrix.txt.gz',
                      sep = '\t',
                      header = T,
                      quote = '',
                      fill = T, 
                      comment.char = "!",
                      check.names = T) #读取表达数据
rownames(exprset) = exprset[,1] #将第一列作为行名
exprset <- exprset[,-1] #去掉第一列
names(exprset) <- names(exprset) %>% substr(3,nchar(names(exprset))-1) # 更改列名

查看表达矩阵：

3. 数据质量检查

#####数据质量检查#####
head(exprset)
library(ggplot2)
library(dplyr)
library(reshape2)
ex = gset[[1]] # 实验相关信息
ph = pData(ex) # 每个样本的详细信息，包括了实验分组，芯片平台等
exprset_long <- melt(exprset) # 宽数据转长数据
# 从ph中可以看到实验分组信息
exprset_long$group <- rep(c("treat","control"),each = 3*nrow(exprset))
# {}代表创建了一个新环境，可以减少中间变量的产生
# 下面的代码依次产生了三幅图形
exprset_long %>% {
  p <- ggplot(.,aes(variable,value,fill = group))
  p1 <- p+ geom_boxplot()+ 
        theme(axis.text.x = element_text(angle = 30,vjust = 0.6),
          axis.title = element_blank())
  p2 <- p+ geom_violin()+
        theme_bw()+
        theme(axis.text.x = element_text(angle = 30,vjust = 0.6),
          axis.title = element_blank())
  p3 <- ggplot(.,aes(value,col=variable)) +geom_density(lwd = 1)+
        facet_wrap(~group,nrow = 2)+ 
        theme_test()+
        theme(axis.title = element_blank())
  print(p1) # 这里如果只输入p1，则图形不会显示
  print(p2)
  print(p3)
  # 依次产生箱线图，小提琴图和密度图
}

可以发现，这是已经标准化之后的数据，并且数据质量好，所以不必再进行标准化。
数据的质量检查完之后，刚开始我直接往下走了，结果发现表达矩阵中是探针ID，还好不是大的失误。在进行后续分析之前，需要进行ID转换。

4. ID转换

一般重要且常用的芯片平台在R的bioconductor里面都是有包的，可以参考生信菜鸟团的博文（http://www.bio-info-trainee.com/1399.html）。

#####ID转换#####
ex # 查看芯片平台，”GPL6244“
BiocManager::install("hugene10sttranscriptcluster.db")
library(hugene10sttranscriptcluster.db)
ls("package:hugene10sttranscriptcluster.db") # 查看包中的数据
symbol <- toTable(hugene10sttranscriptclusterSYMBOL) # 加载探针id和symbol的对应关系
symbol$symbol %>% table() %>% table() %>% barplot(main = "筛选之前") # 查看探针和基因ID之间的对应关系

exprset.probe <- transform(exprset,probe_id = rownames(exprset)) 
exprset.symbol <- merge(exprset.probe,symbol,by = 'probe_id') # merge函数合并，初次筛选
exprset.symbol <- exprset.symbol[,c(8,2:7)]
exprset.symbol <- mutate(exprset.symbol,mean = rowMeans(exprset.symbol[2:7])) 
exprset.symbol <- exprset.symbol %>% arrange(mean) %>% 
  distinct(symbol,.keep_all = T) %>% select(symbol:GSM1052620) # 依据symbol分组，依据mean排序，，之后再删除重复symbol
dim(exprset.symbol) # 查看数据维度
exprset.symbol$symbol %>% table() %>% table() %>% plot(main = "筛选之后") # 查看是否还有重复的symbol

筛选后的表达矩阵：

5. 数据探索

对上一步的表达矩阵清洗

# 将gene symbol转换为首字母大写，其余小写的格式
id <- exprset.symbol$symbol %>% {paste(substr(.,1,1),tolower(substr(.,2,nchar(.))),sep = "")}
exprset.symbol <- mutate(exprset.symbol,symbol = id)
# 这里还有一种更为简便的方法，将gene symbol转换为首字母大写，其余小写的格式
# library(stringr)
# str_to_title(exprset.symbol$symbol)
# 将symbol设置为行名
rownames(exprset.symbol) <- exprset.symbol$symbol
exprset.symbol <- exprset.symbol[,-1]

5.1 PCA分析

#####PCA#####
library(ggpubr)
pca.info <- prcomp(exprset.symbol)
summary(pca.info)
pca.data <- data.frame(sample = rownames(pca.info$rotation),
                       Type = colnames(exprset.symbol),
                       pca.info$rotation)
## 绘制PCA散点图
ggscatter(pca.data,x = "PC1",y = "PC2",
          color = "Type",
          size = 2
)+
  theme_bw()+
  ggtitle("PAC分析")+
  theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5))

5.2 hclust聚类

#####hclust聚类#####
exprset.symbol %>% t() %>% 
  dist() %>% hclust() %>% 
  plclust()

5.3 limma包进行差异分析

#####差异分析#####
library(limma)
group <- c(rep(c("control","treat"),each = 3))
design <- model.matrix(~0+factor(group))
colnames(design) = levels(factor(group))
rownames(design) = colnames(exprset.symbol)
contrast.matrix <- makeContrasts("treat-control", levels = design) 
fit <- lmFit(exprset.symbol,design)
fit2 <- contrasts.fit(fit,contrast.matrix)
fit2 <- eBayes(fit2)
DEG_ot <- topTable(fit2, coef =1, n = Inf)
gpl42872.DEG = na.omit(DEG_ot)
head(gpl42872.DEG)
save(gpl42872.DEG,file = 'gpl42872.DEG.Rdata')

5.3.1 热图

#####热图#####
library(pheatmap)
choose_gene = head(rownames(gpl42872.DEG),25)
choose_matrix = exprset.symbol[choose_gene,]
choose_matrix = scale(choose_matrix)
pheatmap(choose_matrix,show_rownames = T)

5.3.2 火山图

#####火山图#####
logFC_cutoff = with(gpl42872.DEG,mean(abs(logFC))+2*sd(abs(logFC)))
gpl42872.DEG$change = as.factor(ifelse(gpl42872.DEG$P.Value < 0.05 & 
                                         abs(gpl42872.DEG$logFC) > logFC_cutoff,
                                       ifelse(gpl42872.DEG$logFC > logFC_cutoff,
                                              'up','down'),'no-change'))
gpl42872.DEG$logP <- -log10(gpl42872.DEG$P.Value)
library(ggplot2)
ggplot(data = gpl42872.DEG,
       aes(x = logFC, y = -log10(P.Value),
           color = change)) +
  geom_point(size = 2) +
  theme_bw() +
  xlab("log2 fold change") + 
  ylab('-log10 p-value') +
  scale_color_manual(values = c('blue','gray','red'))

5.4 GO and KEGG

GO和KEGG分析的平台很多，比如R语言的topGO包，DAVID网站等等。

#####GO and KEGG####
library(org.Hs.eg.db)
library(topGO)
library(clusterProfiler)
gene <- gpl42872.DEG %>% subset(P.Value < 0.05 & abs(logFC) > logFC_cutoff) %>% rownames()
gene.dt <- bitr(gene, fromType = 'SYMBOL',
                toType = c('ENSEMBL','ENTREZID'),
                OrgDb = org.Hs.eg.db)
dt <- gene.dt$ENTREZID
# GO
ego <- enrichGO(dt,  #基因表
               'org.Hs.eg.db' , #物种包
               keyType = "ENTREZID",
               ont="BP", #GO富集分析的分类，MF-molecular function ,BP-biological process ,CC-cellular compotent
               pAdjustMethod = "BH",
               pvalueCutoff  = 0.01,
               qvalueCutoff  = 0.05,
               pool = T,
               readable = T
)
barplot(ego)
res<- as.data.frame( ego@result)
# KEGG
kegg<- enrichKEGG(dt,
                  organism = "hsa",         #KEGG中物种缩写
                  pvalueCutoff = 0.05,
                  keyType = "kegg",        #KEGG中编号格式
                  pAdjustMethod = "BH",   #多重实验校正
                  qvalueCutoff = 0.2
)
barplot(kegg)
res<- as.data.frame( kegg@result)

GO和KEGG分析网上的教程不要太多，可以直接去生信菜鸟团找。