RNA_seq生物分析学习--RNA-seq实验

第五课 RNAseq样品提取与处理

• RNA-Seq实验流程
  
• 总RNA提取
  
• 样品检测(主要检测样品是否合格,是否发生降解等)
  
• 样品要求
  
• 合格的样品(只有1-2个峰,且长度在1000-4000)
  
• 不合格的样品
  
• 样品检测等级,A最好,D最差

• 低质量样品影响
  
• 总RNA提取,(由于总RNA中包含各种类型的RNA,而常用的是对mRNA进行处理,因此需要在总RNA中提取这1%-5%的mRNA)
  
• 而提取mRNA方法有以下两种:
• 第一 通过多个连续的T与polyA尾巴结合,找到mRNA
  
• 第二 通过去除95%左右的核糖体RNA,剩余5%大约为mRNA
  
• 原核生物纯化(只能通过去除核糖体的方式)
• 下图是减法杂交与核酸外切酶消化两种方法
  
• 减法杂交与核酸外切酶消化两种方法效率,结果显示 减法杂交的效果更好
  
  
• 两种富集方法比较
• 一般来说真核RNA采用磁珠富集方法
• 原核选择去除核糖体RNA的方法,因为这会留下更多信息.而选择polyA方法容易忽略掉那些没有polyA尾巴的mRNA,这部分又常常被人们所关注.
  

第六课 RNAseq建库测序

• 在测序前需要将mRNA反转录为cDNA,对cDNA测序
  

• 这里存在一个问题,是先反转录后打断还是先打断后反转录,由于短序列反转录更容易,所以一般选择先打断后反转录.下面是两种方法比较

• 红色表示先打断后反转录;蓝色表示先反转录后打断.可以看到红色更稳定
  

• 文库大小的选择
  

• 文库构建
  

• 建库测序流程
  

• 注意事项
  

第7课 链特异性文库

• 链特异性文库,即知道该链是反转录中的哪条链(可以知道reads来自cDNA的第一条链还是第二条链)
• 编码链和模板链
• 与mRNA互补的为编码链;与mRNA对应T U不同的为模板链

有的基因的正义链是正链（forword strand），有的基因的正义链是反链（reverse strand）。所以，DNA双链中的一条链对某些基因来说是正义链，对另一些基因来说则是反义链。（https://blog.csdn.net/sixu_9days/article/details/81222407）
由于DNA对于一部分为正义链，一部分为反义链；有没有一种可能是我拿到一条序列之后，把他的互补链也作为一个样本。
所以，这里有个问题是，我要确定这两条链的关系，转录时候确定是某一条链吗？？转录的链有什么规律

• fr-unstranded 非特异性; fr-firststrand和fr-secondstrand为特异性

• 链特异性文库优势(没看懂下面几个优势什么)

• 链特异发现的可变位点数目较少
  

• 下面图显示,这会造成认为基因表达量偏高
  

• 普通文库构建流程
  

• 特异性文库
  
  

• 链特异性文库reads方向