xz10070617

Seurat分析单细胞标准流程

一、数据下载

二、Setup the Seurat Object（设置Seurat对象）

1、安装R包

2、加载R包

3、读入数据

三、Standard pre-processing workflow（标准的预处理流程）

1、QC and selecting cells for further analysis（QC和细胞筛选）

常规质控标准

可视化QC指标

数据标准化

高变基因鉴定

数据归一化

2、线性降维

3、确定数据集的“维度”

JackStrawPlot

ElbowPlot

四、Cluster the cells（细胞聚类）

1、参数调整

2、非线性降维（UMAP/tSNE）

3、寻找差异基因

4、Marker gene可视化

VlnPlot

FeaturePlot

DoHeatmap

五、Assigning cell type identity to clusters（细胞类型鉴定）

1、鉴定方法

2、可视化

六、可视化方法拓展

1、RidgePlot

编辑

2、VlnPlot

3、FeaturePlot

4、DotPlot

5、DoHeatmap

6、FeaturePlot（样本间比较）

7、VlnPlot（样本间比较）

8、DotPlot（样本间比较）

一、数据下载

我们将分析从10X Genomics免费提供的外周血单个核细胞(PBMC)数据集。在Illumina NextSeq 500上测序了2700个单细胞。原始数据可使用下方链接下载：

https://cf.10xgenomics.com/samples/cell/pbmc3k/pbmc3k_filtered_gene_bc_matrices.tar.gz

二、Setup the Seurat Object（设置Seurat对象）

1、安装R包

install.packages("Seurat")
install.packages("dplyr")
install.packages("patchwork")

2、加载R包

library(dplyr)
library(Seurat)
library(patchwork)

3、读入数据


# Load the PBMC dataset（导入数据）
pbmc.data <- Read10X(data.dir = "../data/pbmc3k/filtered_gene_bc_matrices/hg19/")
# Initialize the Seurat object with the raw (non-normalized data)（创建Seurat对象）.
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
#过滤检测少于200个基因的细胞（min.features = 200）和少于3个细胞检测出的基因（min.cells = 3）
pbmc

#注释
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data, project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
counts：#未标准化的数据，如原始计数或TPMs
project：#设置Seurat对象的项目名称
min.cells：#包含至少在这些细胞检测到的features。
min.features：#包含至少检测到这些features的细胞

三、Standard pre-processing workflow（标准的预处理流程）

1、QC and selecting cells for further analysis（QC和细胞筛选）

常规质控标准

（1）在每个细胞中检测到的特异基因的数量：低质量的细胞或空液滴通常只有很少的基因，两个或多个细胞被捕获后可能表现出异常高的基因计数。

（2）细胞内检测到的分子总数(与特异基因密切相关)

（3）每个细胞中线粒体基因的占比：低质量细胞会出现异常的线粒体污染，使用PercentageFeatureSet()函数计算线粒体QC指标，同时，使用以MT-开头的所有基因集作为线粒体基因集。

# The [[ operator can add columns to object metadata. This is a great place to stash QC stats
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(pbmc, pattern = "^MT-")

可视化QC指标

# FeatureScatter is typically used to visualize feature-feature relationships, but can be used
# for anything calculated by the object, i.e. columns in object metadata, PC scores etc.

plot1 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "percent.mt")
plot2 <- FeatureScatter(pbmc, feature1 = "nCount_RNA", feature2 = "nFeature_RNA")
plot1 + plot2

pbmc <- subset(pbmc, subset = nFeature_RNA > 200 & nFeature_RNA < 2500 & percent.mt < 5)
#过滤线粒体基因表达占比过高的细胞，和一些极值细胞（可以根据小提琴图判断，查看两端离群值）。

数据标准化

从数据集中删除不需要的单元格之后，下一步是规范化数据。默认情况下，我们使用全局缩放归一化方法“LogNormalize”，该方法通过总表达式对每个单元的特征表达式测量进行归一化，将其乘以一个比例因子(默认为10,000)，然后对结果进行对数转换。

pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

为了清晰起见，在前面这行代码中(以及在以后的命令中)，我们为函数调用中的某些参数提供默认值。然而，这不是必需的，同样的行为可以通过以下方式实现：

pbmc <- NormalizeData(pbmc)

高变基因鉴定

计算在数据集中显示高细胞间变异的特征子集(即，它们在一些细胞中高度表达，在另一些细胞中低表达)。在下游分析中，这些基因有助于突出单细胞数据集中的生物信号。这一过程在FindVariableFeatures()函数中实现。默认情况下，每个数据集选择2000个特征。这些将用于下游分析，如PCA。

pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# Identify the 10 most highly variable genes（显示top10的高变基因，也可根据实际需要调整参数，如top20）
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

# plot variable features with and without labels
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2

数据归一化

这是PCA降维前的一个标准出来步骤，改变每个基因的表达，使细胞间的平均表达为0，缩放每个基因的表达，使细胞间的方差为1（这一步骤在下游分析中具有同等的权重，因此高表达基因不会占主导地位）。

all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

2、线性降维

接下来我们对缩放后的数据进行PCA分析。默认情况下，只使用先前确定的变量特征作为输入，但如果希望选择不同的子集，可以使用features参数定义。

pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

# Examine and visualize PCA results a few different ways
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)

## PC_ 1 
## Positive:  CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL 
## Negative:  MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2 
## PC_ 2 
## Positive:  CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1 
## Negative:  NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA 
## PC_ 3 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1 
## Negative:  PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11 
## PC_ 4 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1 
## Negative:  VIM, IL7R, S100A6, IL32, S100A8 
## PC_ 5 
## Positive:  GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY 
## Negative:  LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7

可视化PCA结果（几种方式）

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")

DimPlot(pbmc, reduction = "pca")

值得注意的是DimHeatmap()允许轻松地探索数据集中的主要异构源，并且在试图决定将哪些pc包含到进一步的下游分析中时非常有用。细胞和特征都是根据它们的PCA分数排序的。这显然是一个有监督的分析，但这是一个有价值的工具来探索相关的特征集。

DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)

DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)
#dims的参数值可以根据自己的需要调整，比如dims = 1:6，则会输出前6个PCA的热图

3、确定数据集的“维度”

为了克服scRNA-seq数据中任何单一特征中广泛的技术噪声，Seurat基于它们的PCA分数对细胞进行聚类，每个PC本质上代表一个“元特征”，该“元特征”结合了相关特征集的信息。但是，我们应该选择包含多少PCA呢？概括来说就是选择包含信息量大的维度（features），去除信息量少的“干扰”维度。可以通过下面两种方式选择：

JackStrawPlot

JackStrawPlot()函数提供了一个可视化工具，用于将每个PC的p值分布与均匀分布(虚线)进行比较。“有意义”的pc将表现出较低p值(虚线上方的实线)特征的强烈富集。在这种情况下，在第一批10-12台pc之后，重要性似乎急剧下降。

# NOTE: This process can take a long time for big datasets, comment out for expediency. More
# approximate techniques such as those implemented in ElbowPlot() can be used to reduce
# computation time
pbmc <- JackStraw(pbmc, num.replicate = 100)
pbmc <- ScoreJackStraw(pbmc, dims = 1:20)

JackStrawPlot(pbmc, dims = 1:15)

ElbowPlot

另一种选择方法是“肘部图”：基于每个组件解释的方差百分比(ElbowPlot()函数)对主要组件进行排序。在这个例子中，我们可以观察到PC9-10附近的一个“肘”，这表明大多数的真实信号是在前10个pc中捕获的。

ElbowPlot(pbmc)

四、Cluster the cells（细胞聚类）

1、参数调整

首先基于PCA空间中的欧氏距离构造一个KNN图，并基于其局部邻域的共享重叠(Jaccard相似度)细化任意两个细胞之间的边缘权重。这一步是使用FindNeighbors()函数执行的，并将先前定义的数据集维度(前10个pc)作为输入。

FindClusters()函数实现了这个过程，并包含一个解析参数，该参数设置下游集群的“粒度”，值越大，集群数量就越多。我们发现，对于大约3K细胞的单细胞数据集，将该参数设置在0.4-1.2之间通常会返回良好的结果。对于较大的数据集，最佳分辨率通常会增加。可以使用Idents()函数找到集群。

pbmc <- FindNeighbors(pbmc, dims = 1:10)
pbmc <- FindClusters(pbmc, resolution = 0.5)
#####最重要的知识点：dims = 1:10和resolution = 0.5可以调整，值越大，聚类越多，根据实际需要不断调整参数，即可得到自己想要的细胞聚类数。

## Modularity Optimizer version 1.3.0 by Ludo Waltman and Nees Jan van Eck
## 
## Number of nodes: 2638
## Number of edges: 95927
## 
## Running Louvain algorithm...
## Maximum modularity in 10 random starts: 0.8728
## Number of communities: 9（9即为得到9个聚类吗，随着resolution的数值变化，聚类数也随着变化）
## Elapsed time: 0 seconds
#可在这一步不断调整，得到自己想要的聚类数后再进行后续分析

# Look at cluster IDs of the first 5 cells
head(Idents(pbmc), 5)

## AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1 AAACCGTGCTTCCG-1 
##                2                3                2                1 
## AAACCGTGTATGCG-1 
##                6 
## Levels: 0 1 2 3 4 5 6 7 8