2022年中科大细胞生物学实验原理资料
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中国科学技术大学生命科学学院系
2021-2022 学年第 1 学期考试试卷
课程名称： 细胞生物学实验原理 课程代码：____
院系：___________________________ 考试形式：闭卷
姓 名： 学 号： 专 业：
题 号 选择题 名词解释 问答题 合计
得 分 40 12 48 100分
一、选择题（20 × 2）
1.细胞的无菌培养需要用到净化工作室的洁净级别为（）
A 100 B 1000 C 1万 D 10万
[参考答案]C;
净化工作间是基于无菌条件下进行细胞培养操作的场所，设计标准为万级，专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。简称：万级细胞间，百级超净台
2.用于培养细胞的液体培养基，它的灭菌条件一般是用____μm滤膜过滤？
A.0.45 μm B.0.5μm C.0.22μm D.0.3μm
[参考答案]C
细菌的大小普遍是大于或者等于0.2um，但是实际上0.2um大小的细菌很少，0.22um孔径的滤膜足以过滤掉绝大部分细菌，甚至是环境中或者水样中的所有细菌。0.22um，除菌过滤，细菌被截留，并且很多细菌由于受到压力而破，死亡。0.45um，降低微生物负荷，细菌大部分被截留，并且很多细菌嵌入滤膜。培养基灭菌采用0.22um滤膜或高压蒸汽灭菌（营养成分会流失）。
3.下列哪一个描述正确的是？
A台盼蓝可以染死细胞
B可以用平衡盐溶液培养细胞
C.所用的培养基，均可以配置好一个月的用量放在2~8℃冰箱中保存
[参考答案] A
死亡细胞胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡；而普通的液体培养基，密封灭菌后放置在2-8℃冰箱内可以保存三个月，普通的培养基平板可以保存一个月或更久。但是如果培养基中含有易分解的物质，那么保留的时间就很短甚至需要现配现用。但一般培养基保存于4℃冰箱中，培养基内CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中酸碱指示剂的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱后再用于细胞培养将造成细胞生长停滞或死亡。培养基偏碱时，可以通入无菌过滤的CO2，以调整pH值。
4.设定培养细胞的二氧化碳培养箱的条件是____？
A.25℃，5% CO2 B.25℃，10% CO2 C.37℃，10% CO2 D.37℃，5% CO2
[参考答案] D
二氧化碳培养箱是通过在培养箱箱体内模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，培养箱要求稳定的温度(37°C)、稳定的CO2水平(5%)、恒定的酸碱度(pH值:7.2-7.4)、较高的相对饱和湿度(95%)，来对细胞/组织进行体外培养的一种装置。
5.下列哪种溶液不能在含钙镁离子的环境中工作
A胰酶 B胶原酶 C双抗溶液 D谷氨酰氨溶液
[参考答案] A
钙离子和镁离子会影响胰酶的消化能力，导致胰酶消化能力下降，培养细胞时，消化的细胞数量有限，加上细胞的密度依赖性，所以细胞培养时最好使用不含有钙镁离子的PBS缓冲液。
6.实验室用的双抗溶液一般是指____？
A.四环素-链霉素 B.嘌呤霉素-青霉素 C青霉素-链霉素
[参考答案]C
青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin Solution）混合液，通常也被称为“双抗”，是体外培养中为预防微生物污染最常用的抗生素，常配制成100倍浓度母液使用。其中，青霉素能够干扰细菌细胞壁的合成，对革兰阳性菌特别有效；而链霉素能够与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质的合成，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有效，但对革兰氏阴性菌特别有效。青霉素和链霉素联合使用可以预防绝大部分的细菌污染，但青霉素溶液对温度和酸碱度较为敏感，室温易降解，需冷冻保存，PH 6.0～6.5时最为稳定；而链霉素则相对稳定，PH 5.0～7.5时最为稳定
7.对于组织取材的原则不包含____？
A严格无菌 B要用锋利的器械切组织，尽量减少组织的损伤
C尽量选取过分化的组织 D注意快速新鲜，尽量在4~6小时之内完成
[参考答案]C
B取材需要用锋利的器械，正确，C.取材选择新鲜和分化程度低的组织
8.对于用CFSE检测细胞的增殖实验，下列哪一个描述是正确的？
A SFEM是一种可穿过细胞膜的荧光染料
B其与细胞内分子的结合是可逆的
C子代细胞中的荧光强度是亲代细胞的一倍
D对于用流式检测SFEM，可以选择653nm的激光做为它的激发光源
[参考答案]A
CFSE荧光染料是一种可穿透细胞膜的荧光染料，具有与细胞特异性结合的琥珀酰亚胺脂基团和具有非酶促水解作用的羟基荧光素二醋酸盐基团，这使得CFSE成为一种良好的细胞标记物。当CFSE以含有两个乙酸基团和一个succinimidyl ester功能基团的形式存在时，不具有荧光性质，而具有细胞膜通透性，能够自由进入细胞；而当其扩散进入细胞内环境，内源的酯酶可将其乙酸基团水解，此种形式的CFSE分子具有很高的荧光活性，被激发能够产生绿色荧光，却不再具有膜通透性（不可逆）；同时，其含有的succinimidyl ester基团能与胞内的细胞骨架蛋白中的游离胺基反应，最终形成具有荧光的蛋白加合物。因此，当细胞进行分裂增殖时，具有荧光的胞质蛋白被平均分配到第二代细胞中，这样与第一代细胞相比，其荧光强度便会减弱至一半；以此类推，分裂得到的第三代细胞的荧光强度便会比第二代细胞再次减弱。这种现象可以在488nm的激发光下，采用流式细胞仪检测分析，通过检测到细胞荧光强度不断的降低，进一步分析得出细胞分裂增殖的情况。
9.进行细胞冻融时，需遵从____原则？
A.慢冻快融 B.慢冻慢融 C.快动慢融 D.快动快融
[参考答案]A
慢冻，主要是防止细胞在冷冻过程中形成冰晶，对细胞造成损害，加DMSO也是这个原理。 复苏细胞的原则是：快融。 主要是防止DMSO在液体状态下对细胞的毒害作用，快速使细胞进入复苏和生长状态。
10.在培养细胞时，发现细胞培养液中有浑浊且pH值下降，请问是什么造成了其污染？
A真菌 B细菌 C原虫 D病毒
[参考答案]B
(1)细菌污染后培养基的pH值会突然降低，短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生；
有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。
(2)真菌污染：真菌污染培养液清亮透明，丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列
(3)支原体感染：细胞培养过程中, 支原体感染发生率高达30%~60%,支原体是广泛存在于自然界中能独立生活的最小微生物，直径300-800 nm。更易透过0.22-0.45 μm滤膜。受支原体污染的细胞在培养时培养基的pH值不会发生改变, 也不会浑浊，因此, 很难直接观察出细胞是否受到污染。
11.对于自噬的检测，下列说法正确的是
A正常培养的细胞有较高的自噬活性，可以进行直接的自噬检测
B可以用激光共聚焦显微镜直接观察自噬小体的形成
C可以构建GFP-LC3质粒转染细胞，当自噬形成时，细胞中的LC3蛋白会向自噬小体迁移，我们可以检测自噬小体中的荧光点数来判断是自噬的程度
D可以用细胞中的LC3 II/I的比值表示自噬的强弱程度，LC3 II/I值越小说明自噬越强
[参考答案]C
A.正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，错误；
B.自噬小体属于亚细胞结构，普通显微镜镜下看不到，直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化是一种非常直接的方法。
C.在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以 通过计数来评价自噬活性的高低。
D.自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低，值越大说明自噬越强。
12.对于凋亡的检测，用Annexin V/PI，流式结果显示Annexin V+/PI-，请问这一结果预示着细胞处于凋亡的哪个阶段____？
A.凋亡中期 B.凋亡晚期 C.活细胞 D.凋亡早期
[参考答案]D
解析：AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（Propidium Iodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被FITC 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。
13.显微镜的分辨率取决于____？
A物镜 B目镜 C.棱镜
[参考答案]A
显微镜的分辨率是由物镜决定的，分辨率与波长和物镜数值孔径有关系。
14.10x单细胞测序，下列哪一个不是用于控制一个beads和一个细胞结合的
A液流缓慢 B beads数量远大于细胞数
C后期通过QC去除 D让一个beads和一个细胞落在一个96孔板中
[参考答案]D
10x单细胞测序的制样要点：第一是控制cell和beads的流速，第二是beads的数目远远超过cell的数目，即绝大多数的beads都是空的，只有少数的才捕获到了cell。但是还是有个别的droplet里面会两个或者更多的细胞，通过QC进行去除。
15.10x单细胞测序的GEM不包括____？
A逆转录酶 B细胞 C凝胶珠 D转座酶
[参考答案]D
10×制样采用的Gel bead in emulsion(GEM)，凝胶珠、细胞、逆转录酶（反转mRNA）是囊括在内的
16.逆转录病毒的有关叙述错误的是____？
A逆转录病毒可致癌
B逆转录病毒可以转染非分裂的细胞
C逆转录病毒感染效率高，且细胞不容易死亡
D 逆转录病毒的转染效率高，被感染的细胞可以持续多代繁殖
[参考答案]B
逆转录病毒的特点 ：①就目前所知,在大多数情况下,逆转录病毒的肿瘤基因（oncogene,ONC）都能够在细胞中转录. ②逆转录病毒的寄主范围相当广泛,包括无脊椎动物,其中有的还能够在人体细胞中生长； ③逆转录病毒不但感染效率高,而且通常不会导致寄主细胞的死亡,被它感染的或转化的动物细胞能够持续许多世代,保持正常生长和保持病毒感染性的能力，但逆转录病毒的缺点是只能感染能够分裂的细胞，同时整合的时候会导致宿主基因组突变，有潜在的致瘤性。
17.分别取两个品种的小鼠对它进行照射，检测小鼠尿液中的白蛋白含量（+++，++，+），若要比较小鼠的差异情况应选择哪种分析方法？
A. T检验 B f分析 C卡方分析 D非参数检验
[参考答案]A
A.如果是同一组患者治疗前后某项指标的变化是否存在显著差异，通常可以采用配对样本T检验的方式进行考察。配对T检验与独立T检验其中比较容易混淆的是独立样本t检验和配对样本t检验。两者的主要区别在于：配对样本t检验需要两组样本数相等，且要求每对配对数据之间要有一定的对应关系，而独立样本t检验两组数据的样本个数可以不等。
B.F分析：用于两个及两个以上样本均数差别的显著性检验。 由于各种因素的影响，研究所得的数据呈现波动状
C.卡方检验是一种用途很广的计数资料的假设检验方法。它属于非参数检验的范畴，主要是比较两个及两个以上样本率( 构成比）以及两个分类变量的关联性分析。其根本思想就是在于比较理论频数和实际频数的吻合程度或拟合优度问题。
18.对于CRISPER-Cas9技术的优势描述，下列错误的是
A只需要sgRNA，就可以对目的DNA进行特异修饰
B sgRNA比较小，容易合成
C特异性
D sgRNA短，载量低，避免了载量高带的并发症
[参考答案]A
CRISPER-Cas9要对目的DNA进行特异修饰，需要同时提供oligo修复模板
19.研究蛋白互作的技术不包括____？
A.SPR B.qPCR C.Co-IP D. FRET.
[参考答案]B
A.SPR 表面等离子共振（SPR）是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。
C. Co-IP 免疫共沉淀，经典的蛋白互作研究技术
D. 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是较早发展起来的一门技术，随着绿色荧光蛋白应用技术的发展，FRET已经成为检测活体中生物大分子纳米级距离和纳米级距离变化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、细胞生理研究、免疫分析等方面有着广泛的应用。
20.首先提出假设（由于未经检验是否成立，所以称为无效假设），用适当的统计方法确定假设成立的可能性大小，如果可能性小，则认为假设不成立，拒绝它；如果可能性大，还不能认为它不成立，这是（ A ）的过程；
A.反证法思想 B.小概率思想 C.假设检验 D.大概率思想
[参考答案]A
假设检验的原理：假设检验的基本思想是反证法和小概率思想。
反证法思想：首先提出假设，用适当的统计方法确定假设成立的可能性大小，如果可能性小，则认为假设不成立，拒绝它。
小概率原理：是指小概率事件在一次随机试验中基本不会发生；概率小于多少算小概率是相对的，在进行统计分析时要事先规定，即检验水准。
二、名词解释（3分/题）
1.一代生存期
培养细胞的“一代生存期”，是从细胞接种后到再次传代培养之前的这一段时间。细胞传一代后，一般历经3个阶段潜伏期、指数生长期、衰退期。
2.sgRNA
sgRNA在CRISPR-Cas9基因编辑系统中具有准确识别靶基因序列的作用。也称向导RNA（guide RNA，gRNA），作用于动质体（kinetoplastid）体内一种称为RNA编辑（RNA editing）的后转录修饰过程中。也是一种小型非编码RNA。可与pre-mRNA配对，其效果可影响编辑的效率、是否发生脱靶。
3.瞬时转染
瞬时转染（transient transfection）是将DNA导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组DNA导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的DNA不必整合到宿主染色体，可在比稳定转染较短时间内收获转染的细胞。
4.组织工程
组织工程是应用细胞生物学和工程学原理,将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增,然后移植到人体内所需要的部位,从而达到器官修复或再造的治疗目的的一种技术。
三、简答题（48分）
1.简述光学显微镜和电子显微镜的区别
区别：
1．光学显微镜使用可见光作为光源，而电子显微镜利用高能短波长电子束代替可见光。
2．光镜的聚焦镜使用光学学镜片，电镜则使用电磁透镜。
3．成像系统不同。光学显微镜是利用振幅衬度，而电子显微镜是利用相位衬度，借助CCD成像
4．放大倍数不同，光镜一般最大能放大到2000x，电镜则可高达数十万倍。
5．光镜仅能观察到表面微细结构，电镜可获取晶体结构、微细组织、化学组成、电子分布情况等。
或：
电镜 光学显微镜
光源 电子束 可见光
光镜聚焦镜 电磁透镜 光学棱镜
成像系统 荧光屏、底片、CCD 凸透镜放大
成像机制 相位衬度 振幅衬度
分辨率 nm，亚显微结构 um，显微结构
样品要求 真空成像，厚度50 -80 nm左右 切片厚度 3- 5 um
2.流式细胞术四种对照和作用
1.空白对照 (negative control) 自发荧光/本底荧光对照 未染色的细胞 空白对照：不进行任何标记的细胞，主要目的是用于测定基础荧光信号表达值。
2.同型对照：使用同种型抗体做平行实验，主要目的是消除抗体与样本的非特异性结合而产生的背景。
3.荧光补偿对照：当多种荧光被单波长激发时，荧光发射光谱会产生重叠，为纠正荧光光谱重叠-细胞样本分别用单独的荧光抗体染色，来决定荧光重叠的水平，确定适合补偿
4.阳性对照：一般会使用已知的高表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是排除实验中实验方法、试剂、操作等实验的影响因素。
3.统计学分析方法选择注意因素
1、看资料中的反应变量是单变量、双变量、多变量。
2、看属于这三种资料里的哪一种，计量资料、计数资料、等级资料
拿到数据开始分析之前，一定要进行数据类型的划分
3、看是单因素还是多因素
4、看是单样本、两样本、还是多样本
5、看是否是配对或者配伍设计
6、看是否满足检验方法所需要的前提条件
4.蛋白X与IFN-β抗病毒信号转导通路有重要作用，蛋白X与IFN-β结合后被泛素化，设计实验方案确定蛋白X是否被泛素化 泛素化的位点和介导的E3泛素连接酶类型
（1）目的蛋白是否被泛素化？
①WB检测：目的蛋白降解与蛋白酶体有关
②正反向IP实验：WB检测泛素IP下来的蛋白中是否有目的蛋白
③蛋白酶体抑制剂能够抑制目的蛋白的降解
（2）目的蛋白被哪个E3所催化泛素化，确定泛素化的类型
确认泛素连接酶，并当使用突变的泛素时，不能使目的蛋白泛素化
（3） 确定目的蛋白泛素化的位点
- 质谱鉴定
- 突变确定可能的区域突变其中的lysine回补实验
5.蛋白A在跨膜蛋白，有胞外区、胞内区、跨膜区，确定蛋白A在小鼠各脏器表达的转录水平和蛋白水平，并设计实验证明A基因过表达敲除或降低表达水平对细胞增殖活、细胞凋亡的影响（简述实验设计和方案）
实验设计：
1、qPCR引物检测蛋白A在各组织的表达、WB检测各组织的蛋白表达水平
2、采用shRNA敲低或CRISPR-CAS9敲除、过表达载体进行过表达，采用WB进行验证敲除或过表达效率
3、在第2步成功基础上，根据其可能的功能，检测敲除或过表达后细胞增殖和凋亡
（1）细胞增殖 ：
MTT检测法、羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)检测法 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测法
CCK 、Ki67检测法进行，优先选择Brdu,可以检测活体
（2）细胞凋亡检测
形态学检测：
光学显微镜和倒置显微镜1、未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
其他检测方法
1.染色细胞 ：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割
2.Annexin V /PI:
3. DNA 片段化
4. TUNEL
5. 线粒体膜电位 ：而线粒体跨膜电位的下降 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件
6. 细胞色素c释放
7. Caspase活性
8. 凋亡相关蛋白检测
中国科学技术大学生命科学学院系
2020-2021 学年第 2 学期考试试卷
课程名称： 细胞生物学实验原理 课程代码：____
院系：___________________________ 考试形式：闭卷
姓 名： 学 号： 专 业：
题 号 选择题 名词解释 问答题 合计
得 分
二、选择题（12 × 3）
1.洁净实验室主要是通过人为的手段，应用洁净技术实现控制室内空气中尘埃、含菌浓度、温湿度与压力、以达到所要求的洁净度、温湿度和气流速度等环境参数。洁净度是指每升空气中所含粒径≥0.5um的尘粒的总颗粒，实验细胞间常用的超净工作台洁净度等级为（A）
A.100级
B.1000级
C.10000级
D.100000级。
2.HELA细胞系在正常情况下为（ A ）
A.贴壁生长 B.悬浮生长 C.半悬浮生长
3.以下（ B ）采用结构光照明的方法，可用于微管蛋白动态的分析。
A.STED B.SIM C.STROM D.MINFLUX
4.洁净度级别为10000级,浮游菌的最大允许数为100每立方米,沉降菌的最大允许数为每皿
（ B ）
A.1每皿 B.3 每皿 C.10每皿 D.15每皿
5.细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化，常用的细胞冻存液的配方比例为（ A ）。
A.10%DMSO+20%血清+细胞培养基 B.5%DMSO+10%血清+细胞培养基
C.10%DMSO+细胞培养基 D.10%血清+细胞培养基
6.RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。下面关于siRNA说法错误的是（ C ）
A.siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究
B.以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。
C.载体介导的细胞内表达siRNA一般不可建立稳定表达的细胞系。
D.siRNA表达框架是一种由PCR得到的siRNA表达模版，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。
7.下面关于细胞实验常用的胶头滴管说法错误的是（ B ）
A.使用时胶头在上，管口朝下，防止液体进入胶头使得胶头腐蚀
B.滴管管口在滴加时伸入受滴容器，缓慢加入
C.滴瓶上的滴管必须与滴瓶配套使用
D.胶头滴管的清洗可以采用浓盐酸或重铬酸钾+浓硫酸
8.首先提出假设（由于未经检验是否成立，所以称为无效假设），用适当的统计方法确定假设成立的可能性大小，如果可能性小，则认为假设不成立，拒绝它；如果可能性大，还不能认为它不成立，这是（ A ）的过程；
A.反证法思想 B.小概率思想 C.假设检验 D.大概率思想
9.（ B ）是目前较为肯定的核增殖标志物，只在增殖期表达(G1，S和 G2/M期)，Go期缺失。与细胞有丝分裂密切相关，预示将进入分裂期的细胞数目。它在细胞有丝分裂过程中维持DNA结构的稳定性，在多种恶性肿瘤中过表达，其表达水平可用于评价细胞的增殖状态、肿瘤的生物学行为。
A.Edu B.Ki-67 C.PCNA D.CFSE
10.荧光染料（ A ）是一种很有价值的细胞标记示踪剂，不仅用于细胞增殖的体外实验,也可用于追踪细胞在体内的分裂增殖以及迁移过程。
A.CFSE B.BrdU C.Edu D.MTT
11.在细胞的体外培养过程中，诱导细胞定向分化、维持、调控乃至优化这种分化，从
而形成具有和在体组织相似功能的组织或器官,其中以下不属于组织工程的3大要素的是（ D ）。
A.种子细胞 B.生长因子 C.细胞外基质 D.动物器官
12.CyTOF质谱流式细胞仪采用（ C ）标记或识别细胞表面和内部的信号分子，然后利用流式细胞仪原理分离单个细胞，再用感应耦合等离子质谱（ICP-MS）观察单个细胞的原子质量谱，将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部信号分子数据，通过专业分析软件对获得数据进行分析，从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。
A.卤素 B.蛋白 C.金属元素 D.探针
三、名词解释（12 ×2 ）
1.原代培养（primary culture）：也称初代培养。即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续 1 一 4 周。完成了从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了分裂增殖与生长发育的能力。
2.培养细胞的“一代生存期”：所谓培养细胞的“一代生存期”，是从细胞接种后到再次传代培养之前的这一段时间，分为：潜伏期、对数生长期和停滞期。
3.流式细胞术（FCM）：是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或颗
粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）进行快速多参数定性或
定量检测和分选的一种细胞分析技术.
4.MTT 检测法：主要反映细胞的能量代谢，是检测细胞增殖活力的一种简便准确的方法。
其原理是在活细胞生长和增殖过程中，线粒体内的脱氢酶可将黄色的 MTT 分解成兰紫色的
水不溶性的甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中，死细胞无此功能。
5.同型对照：用与实验抗体相同种属来源、相同剂量的抗体作为对照，消除抗体非特异性
结合到组织细胞而产生的背景染色（Ig isotype control）。
6.荧光共振能量转移（FRET）:指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体 Donor）的发射光谱与另一个基团（受体 Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时（一般小于100Å），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，用于研究两个已知蛋白质之间是否存在互作。
7.细胞信号转导：细胞通过位于胞膜或胞内的受体感受胞外信息分子的刺激，经复杂的细胞内信号转导系统的转换来影响细胞的生物学功能，这一过程称为细胞信号转导。
8.共焦显微术：激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)是在荧光显微镜成像基础上配置激光光源和扫描装置，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦装置，利用计算机进行图像处理，对观察样品进行断层扫描和成像，是一种高敏感度与高分辨率的显微镜
9.分辨率（ resolution）：标本上两点之间的最短距离，R= 0.61 λ / NA，其中λ为波长（对于荧光显微镜，就是荧光探针的发射波长）；NA为物镜的数值孔径。
10.组织工程：是应用细胞生物学和工程学原理,将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种
生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增,然后移植到人体内所需要的部位,从而达到器官
修复或再造的治疗目的的一种技术。
11.成体干细胞 adult stem cells 又称为组织干细胞，是存在于成体组织的未分化细胞，具有自我增殖更新能力和多向分化潜能
12.完全随机设计（completely random design)：是指不加任何条件限制，应用随机数字表或随机排列表将观察对象随机地分配到试验组和对照组;
三、简答题：（40）
1.请给出转染的定义，并写出至少3种转染的方法及原理
转染(transfection)：指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术
（1）化学介导：1973年Graham和Eb在磷酸钙的存在下通过病毒DNA转化哺乳动物，开启了基因在细胞中瞬时表达的大门。
（2）电穿孔法：通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术可以将核苷酸、DNA 与RNA、蛋白类、染料及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。
（3）慢病毒 Lentivirus转染：慢病毒感染宿主细胞时，可以将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立
2.如何采用一种染色方法就可以区分正常细胞、细胞凋亡（早期、中晚期）及细胞坏死？
答：Annexin V/PI 染色
（1）Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，而在凋亡细胞早期 凋亡细胞的细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使PS暴露在细胞膜外表面。Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。
（2）碘化丙啶(propidine iodide,PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来：
（3）活细胞不能被Annexin V-FITC或PI染色
（4）早期凋亡细胞因磷脂酰丝氨酸的暴露及具有完整细胞膜，故Annexin V-FITC染色阳性及PI染色阴性
（5）坏死或晚期凋亡的细胞呈Annexin V-FITC及PI染色双阳性。
3.蛋白质磷酸化是指由蛋白质激酶催化的把ATP的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上的过程，是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用，请问蛋白的磷酸化如何检测？
（1）使用特异性抗磷酸化蛋白抗体（p-Thr、p-Ser 和p-Tyr ）结合 Western blot
免疫组化和免疫荧光进行检测
（2）流式细胞术
（3）质谱分析法，如采用高通量磷酸化修饰组学筛选激酶的底物蛋白
（4）放射性核素32P 同位素放射性标记法：用 32P 同位素放射性标记磷酸盐作为磷酸基团供体，经过磷酸化酶促反应，带有 32P 同位素放射性标记的磷酸基团则转移到相应的反应蛋白上，通过凝胶电泳分离，可以用放射自显影或磷光成像仪检测磷酸化蛋白质。
（5）激酶活性测定：蛋白激酶与磷酸酶抑制剂的应用
- 流式细胞术中的前向散射光(forward scatter, FSC)、侧向散射光（side scatter, SSC)的意义，为什么要进行设门法？
（1）相对大小 前向散射光(forward scatter, FSC)：
（2）相对颗粒度密度等内部结构属性 侧向散射光（side scatter, SSC)
（3）FCM设门法：用门选择某一或某 用门选择某 或某些特性（荧光特性或散射光特性）的细胞 对门内的细 细胞，对门内的细胞群体作进一步的分析 它是定性细 分析，它是定性细胞亚群的重要方法
5.解释什么是干细胞的不对称分裂？按分化特征分，干细胞分为哪3类？各给出一个例子
干细胞的不对称分裂：
（1）干细胞一方面进行自我更新（selfrenew)，产生与亲本完全相同的子代细胞，以保持干细胞数量的恒定；
（2）另一方面在一定条件下可以进入分化程序，通过不对称分裂产生分化的子代细胞，最终形成功能特异的组织类型，在组织修复和新陈代谢中起重要作用。
按照分化特征分：
（1）全能干细胞(Totipotent stem cell)具有形成完整个体的分化潜能，如受精卵
（2）多能干细胞(pluripotent stem cell)具有分化出多种细胞组织的潜能，如造血干
细胞、神经干细胞。
（3）单能干细胞(multipotent stem cell)只能向一种或两种密切相关的细胞类型分化，
如神经元干细胞只能分化成神经元。
6.什么是假设检验的两类错误？增加样本量可能会对会对统计分析结果产生什么样的影响？
（1）2类错误是相对 假设检验时提出原假设和备择假设：
第一类错误（Ⅰ类错误）也称为 α错误，是指当虚无假设(H0)正确时，而拒绝H0所犯的错误。这意味着研究者的结论并不正确，即观察到了实际上并不存在的处理效应 弃真
第二类错误（Ⅱ类错误）也称为β错误，是指虚无假设错误时，反而接受虚无假设的情况，即没有观察到存在的处理效应。取伪
（2）增大样本量的影响：
1.增大样本量可以使两类错误降低：如果扩大了样本容量，那么抽样得到的值越接近于真实水平，那么如果原假设是成立的，这个抽样算出来的值（接近真实的值）很大程度上不会出现在拒绝域，因而减小了弃真误差。取伪误差同理。但在样本容量确定的情况下，α与β不能同时增加或减少。
2.增加样本含量可以缩小变异系数，更接近真实情况，科学价值更高。
往届考试题汇总
题型：选择题（40×0.5），名词解释（5×3），问答题（7×5）
选择题考点回顾：
√1、K562 cell line（人类慢性髓原白血病）属于（悬浮细胞）
√2、常用的培养基是
√3、悬浮细胞常用的培养基是
√4、贴壁细胞常用的培养基是
√5、细胞生存全过程经历的阶段是
√6、细胞传代一次后经历的阶段是
7-10、给一张细胞图，问是什么类型的细胞，问是处于哪个生长时期的细胞，问是受了什么污染。
11、胎牛血清不必灭活。
√12、解冻血清：-20℃至4℃至室温，切忌-20℃至37℃。
13、HEPES对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH范围。
14、合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50%，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
15、胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。4℃保存一周，室温30分钟后不稳定。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。
16、台盼蓝法：活细胞不被染色，死细胞染成蓝色。
√17、消化细胞传代不能用：（不是酸性环境不能采用胃蛋白酶）
A、胰蛋白酶 B、EDTA C、胃蛋白酶 D、胶原酶
18、Annexin V /PI双染法：
正常活细胞Annexin V 、PI均低染；
凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；
坏死细胞Annexin V/PI均高染
19、CFSE染色：检测细胞增殖
20、TUNEL染色：检测细胞凋亡
21、冻存和复苏的原则：慢冻快融
22、细胞冻存时对细胞影响最大是（形成大的冰晶）
23-24、利用荧光染剂（bisbenzimide, Hoechst 33258）检测支原体污染。给了荧光图，判断是（支原体污染）。
支原体污染的一种常规检测方法是对细胞进行DAPI染色，在支原体污染的细胞中除了观察到正常的细胞核，细胞质也有大量的絮状核酸物质被染成蓝色，这些处于细胞质的核酸物质就是支原体DNA，说明细胞支原体污染非常严重。
25、支原体污染后的抗生素处理：四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮
26、Hela是（宫颈癌上皮细胞）
27、CTCs属于什么类型的细胞
28、动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology）是指在人工条件下（设定pH、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（bioreactor）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。
29、初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。
30、已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。
31、从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。
32、UNG酶的作用原理是降解含有dU的双链或单链DNA。
4*dNTP加入比例：
dCTP， dGTP， dUTP， dATP＝1：1：2：1
dCTP， dGTP， dUTP， dTTP， dATP＝1：1：1：0.5：1
33、临床基因扩增检验实验室负压的区域是
34、我国把BSL-3和BSL-4实验室平面布局明确分为：“三区二缓”的结构。生物安全柜放在
35、进行大肠杆菌实验的实验室是几级实验室
名词解释：
1、万级净化与百级净化
2、正置显微镜与倒置显微镜
3、FSC与SSC
4、RNA干扰与siRNA：是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNAs 时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，它发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默
5、生物气溶胶：气溶胶是指悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001-100μ m的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系。分散相含有生物因子的气溶胶
6、GFP：可溶性绿色荧光蛋白，最早是在一种学名Aequoreavictoria 的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光。转染后的细胞可在活细胞工作站或流式细胞仪(FACS) 中直接观察或检测基因的表达。
7、荧光漂白恢复技术:利用高能激光照射细胞的某一特定区域，使该区域内标记的荧光分子不可逆的淬灭。随后，由于细胞质中的脂质分子或蛋白质分子的运动，周围非漂白区荧光分子不断向光漂白区迁移。结果使荧光漂白区的荧光强度逐渐地回复到原有水平。
8、cell工作站技术：活细胞工作站技术是在活细胞状态下研究细胞分裂、迁移、衰老、以及凋亡的必要手段，这种系统模拟活细胞的生存环境，可以维持活细胞长时间的正常生长繁殖、长时间连续追踪观察;能够在亚细胞水平观察线粒体、内质网、高尔基体和染色体等在细胞周期及细胞执行生理功能中的动态变化；能够在分子水平直接观察对生物大分子复杂的结构和功能在细胞水平上进行研究，最终揭示生物发育、进化的基本规律
9、净化工作室:对尘埃数及微生物数严格控制的洁净室。
10、FRET：分子可以看作为正负电荷分离的一个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转移
FRAP:FRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测,因而可得到活细胞的动力学参数。
11、万能无限远（UIS）校正光学系统：光线通过物镜后成为平行光束通过镜筒，并在结象透镜处折射或完成无相差的中间象。物镜与观察筒内结象透镜之间可添加光学附件，而
不影响总放大倍数不需要安装附加校正透镜
简答：
1、细胞培养过程中所加的各种组分的作用：
2、癌细胞培养的条件：
3、干细胞培养的条件及注意事项：
4、正置显微镜与倒置显微镜区别：
正置显微镜
标准盖玻片厚度0.17mm ，载玻片厚度1.1mm
载物台与物镜间的工作距离有限
清晰度高 物镜最大放大倍数 150X
主要用于切片的观察
倒置显微镜
物镜、聚光镜、光源的位置颠倒 长工作距离物镜和聚光镜
透射光源和载物台之间空间更宽敞 清晰度略低于正置
物镜最大放大率60X ；
多用于无色透明的活体观察，如组织培养、细胞离体培养、浮游生物、环境保护、食品检验
5、LSCM的三维重建图像技术 : 通过对样品在x-y方向上的逐点扫描，可以形成二维图像。如果调解焦平面在z 方向的位置，连续扫描多个不同z 位置的二维图像，则可以形成一个3D图像，3D的重建需要软件的支持。揭示亚细胞结构的空间关系，从而能十分灵活直观地进行形态学研究。
6、各种显微镜的优缺点：
7、激光显微切割技术及其应用：在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统从组织切片中分离、纯化单一类型样品（组织、细胞、细胞群、胞内组分、染色体区带等）并收集用于后续研究的技术。
基本原理：在直接光学显微观察的基础上，利用激光能量对特定的组织或细胞类型进行切割，切割后的样品和膜会粘在Eppendorf管盖上，以完成收集，在从而获得均一性的样品。
用途：主要应用于石蜡、冰冻切片、细胞培养片以及细胞涂片等各种样本的特定类型细胞的分离。用于解决样本的异质性问题，是样本收集的一项革命性技术。应用此技术往往是许多要深入研究的工作中起始的重要一步。
8、活细胞工作站技术中使用塑料培养皿和玻璃培养皿的区别：
9、流式细胞仪的原理，应用及数据表现：流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。
将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时, 受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号，荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号,可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析。
10、 细胞转染的主要方法及原理：
物理介导：电穿孔法，电穿孔靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞内。
显微注射，
基因枪，基因枪依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导入细胞内。
化学介导：
磷酸钙共沉淀法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA 复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。
DEAE- 葡聚糖法，
脂质体转染方法，中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体则不同，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物，从而吸附到带负电的细胞膜表面，经过内吞被导入细胞。
生物介导：原生质体转染
病毒介导的转染，以病毒作为载体, 通过病毒感染的方式将外源DNA 导入到细胞中, 其中
以逆转录病毒及腺病毒转染系统最为常用
9、生物发光应用举例
荧光素酶：可以做报告基因进行检测，将荧光素酶基因连接到目的基因上，检测经过外界刺激后，目的基因是否表达及表达的量。 两种荧光素酶做报告基因，实验质粒上带有绿色荧光素酶基因，对照质粒上带有红色荧光素酶基因，然后用红色荧光素酶基因作对照做归一实验数据。
ATP：细胞活性检测，在活性哺乳动物细胞中，ATP水平被严格调控，一旦细胞死亡，ATP水平急剧下降。荧光素只在有ATP存在下，才能被荧光素酶催化反应，发出荧光。死细胞中无ATP所以不会发出荧光，活性细胞中可以产生荧光。
荧光素：偶联荧光素，将化合物A上偶联上荧光素形成新的化合物B，此新的化合物B在特定酶或待检测酶的作用下会被分解，暴露出游离的荧光素，这样再在荧光素酶的催化作用下，就会发出荧光。用来检测目的酶等
在报告基因技术中，为什么需要快速反应荧光素酶基因（现存报告基因的缺点）：1）希望报告基因应答与细胞事件在时间上更快地耦联。2）需要更强的应答，不稳定荧光素酶基因比非不稳定的应答更强。3）较长的孵育时间可能导致检测到次级效应（假阳性）。
10、SPR与ITC
表面等离子共振原理：SRP检测芯片表面液体的折射率变化与结合分子的质量成正比。比较SPR与ITC：
SPR ITC
原理 测量折射率变化 测量热量变化
分子量 有范围限制，100Da以下基本检测不到，100Da以上有可能检测到 无分子量要求
样品消耗量 较少，只需几微克 相对较多，10微克以上
耗材 芯片 无
配体固定 需要固定在其中的一个分析物 不需要
通量 可以有较大的通量，一般是单通量的 不同仪器通量不同，多数只能测一个，有的可能达到上百个
获得参数 KD Kd N：结合比 △H：热量信息
相同点：无需标记，实时监测，都适用于混浊、不透明或有色液体的检测。
11、PCR引物设计原则：
1）一般长度在20—30mer 2）应当避免多聚碱基
3）避免反向重复序列，以防产生二级结构
4）多个引物时，引物之间不能互补，以防产生杂交配对
5）如果可能尽量使3’末端富含GC 6）两个引物之间不得高于10Kb的长度。
Ct值：RT PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
荧光定量PCR原理：是指在PCR反应体系中加入荧光集团，该荧光基因特异地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的的荧光基团不会发射任何荧光信号。利用荧光信号的变化实时检测PCR反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。
检测方法：
荧光染料嵌合法，SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
和荧光探针法，Taqman探针法，TaqMan探针为一寡核苷酸，5 ’端标记一个报告基团(Reporter)，3 ’端标记一个淬灭基团(Quencher)。
RT-PCR解析方法：
绝对定量，通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。
相对定量，由于在实际目的基因的表达量分析过程中，细胞起始数、RNA提取效率及目的基因扩增效率不可能相同，因此需通过用内对照基因（管家基因）校正。通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。
怎样确定CT值：Ct值，RT PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
实验操作中，CT值定义为在基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的PCR循环次数。“基线上方”也就是阈值高度的量化定义是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍。阈值所在的横线与PCR扩增曲线的交点所指的PCR循环次数就是CT值。基线范围的定义是从第3个循环起到CT值前3个循环止。CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量，CT值是一个完全客观的参数。CT值越小，模板DNA的起始拷贝数越多；CT值越大，模板DNA的起始拷贝数越少。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。
1、荧光定量PCR中的相对定量和绝对定量
绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目，即通常所说的拷贝数。相对定量的目的是测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例，而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。
绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对百分比
2、根据萤火虫荧光素酶的反应式，说说此反应在生物学研究中的应用。
3、活细胞time-lapse的注意事项。活细胞工作站与激光共聚焦的区别。
4、生物或化学发光研究DNA与Pro相互作用（凝胶阻滞）
5、染色体法检测细胞凋亡的几种方法的原理。
2021-2022复习重点
第1课：真核细胞转染与表达
1.转染的概念
转染技术(transfection)是：指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术
转化Transformation:1928年格里菲斯肺炎双球菌转化实验（质粒载体，转化细菌）
转导Transduction：P22噬菌体侵染实验（噬菌体载体，转导细菌）
为什么需要应用转染试剂：DNA带负电荷、亲水，细胞膜带负电荷、疏水，借助阳离子基团可以将外源DNA转入。
2.转染的常用方法和原理
（1）化学介导：
·1973年Graham和Eb在磷酸钙的存在下通过病毒DNA转化哺乳动物，开启了基因在细胞中瞬时表达的大门
优点：
缺点：·细胞有（）·重复性不佳 ·试剂条件要求高，偏离最优条件1/10个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
（2）DEAE-葡聚糖法（是一种阳离子聚合物）
优点：· · ·基于DEAE-dextran的细胞转染方法不仅可以转染（），也可以转染（）
缺点：浓度高时有一定细胞毒性，不适合于稳定转染
（3）PEI （Polyethylenimine聚乙烯亚胺）
优点：
缺点：有一定细胞毒性
（4）脂质体 脂质体转染色时的细胞密度 70-90%融合度为佳
优点：·适用于把ＤＮＡ转染入悬浮或贴壁培养细胞，可用于瞬时转染和稳定转染 ·能把DNA和RNA转染到各种细胞 ·转染的稳定性好，可重复性高
缺点：贵，有毒性
·磁性纳米颗粒介导
（2）物理介导：
（2.1）电穿孔法（电穿孔仪 电转杯）
通过高强度的电场作用，瞬时提高细胞膜的通透性，从而吸收周围介质中的外源分子。这种技术可以将核苷酸、DNA 与RNA、蛋白类、染料及病毒颗粒等导入原核和真核细胞内。
Lonza公司：Nucleofector 转染效率越高，细胞存活率越低
Invitrogen公司：Neon transfection system 改进了电转的容器，电流更均匀，对细胞毒性更小
电穿孔法的特点：
优点：转染效率高，特别是对一些其他方法很难转染的细胞，比如原代细胞
缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪），对细胞的损伤还是较大，每次转染都需要更多的细胞和DNA，每种细胞电转条件都需要进行多次优化。电刺激广泛影响了细胞许多生物学过程
（2.2）显微注射（microinjection）
优点：·没有DNA长度上的限制 ·细胞类型广
缺点：
（2.3）基因枪技术（微粒轰击技术 Particle Bombardment Technology） 微米级金或者钨上，微粒加速装置
优点:·可以输送大片段DNA，可以进行多质粒共同导入
缺点：·可以造成外源基因的断裂，使插入的基因成为无活性的片段
（3）病毒介导的转染：
·以基因改造过的病毒为媒介，利用产生的假病毒颗粒感染靶细胞，从而把目的基因导入细胞。
（适用范围：）
·腺病毒
特点：无包膜的线性双链DNA病毒
构建腺病毒转染系统的要素：
需要1.腺病毒基因组质粒（骨架质粒）（缺少E1和E3），骨架质粒不能复制 2.穿梭质粒，含有多克隆位点，可以插入目的基因片段，穿梭质粒可以用与骨架质粒进行同源重组 3.目的基因片段 4.包装细胞293或293T细胞（可以产生腺病毒包装蛋白E1）；产物是带目的基因的重组腺病毒颗粒。
·逆转录病毒
逆转录病毒是RNA病毒，但有逆转录酶，可以使得RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。
逆转录病毒的特点①在大多数情况下，逆转录病毒的肿瘤基因能够在细胞中转录；②寄主范围广；③不但感染效率高，而且通常不会导致寄主细胞的死亡，被它…
优点： 缺点：
·慢病毒 Lentivirus
一种很常用的哺乳动物病毒表达系统，慢病毒感染宿主细胞时，可以将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于基因过表达稳定细胞株的建立和RNAi的研究。
慢病毒载体：HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体，区别1般的逆转录病毒载体，它对分离细胞和非分离细胞均具有感染能力。
3个质粒转染293T -重组慢病毒颗粒释放到上清中 - 转导 -逆转录出DNA -整合并表达
转染效率的检测：
1.流式细胞术
2.免疫荧光:通过DNA产物荧光标记检测
3.Western blotting：：检测目的蛋白的表达
4.qPCR：如基因沉默的检测
1.稳定转染细胞的构建：
·瞬时转染：是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上。外源基因导入细胞1-2天后收获细胞进行检测和分析。一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达
·稳定转染：DNA整合到宿主细胞的染色体中。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合。
通常需要通过一些选择性标记反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。
·2者操作上的差别：1.质粒：2.转染方式的区别，操作步骤上
·稳定转染的筛选药物：G418 puromucin
2.影响转染效率的主要因素
1.细胞：
细胞密度以70-90%（贴壁细胞）或 2×106 － 4×106细胞／ml（悬浮细胞）为宜，最好在转染前4小时换一次新鲜培养液
2.血清及抗生素
OPTI-MEM培养基：一种营养丰富的无血清培养基
3.DNA质量
4.转染技术
常见问题：
（1）转染效率低
（2）细胞死亡率高
复习题
1.稳定转染和瞬时转染的常用方法并举例
（1）瞬时转染：是指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合到细胞的染色体上
Key: 腺病毒表达系统、磷酸钙、葡聚糖、PEI 中的2种
稳定转染：DNA整合到宿主细胞的染色体中。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合。
Key: 逆转录病毒、慢病毒、脂质体法、显微注射、基因枪中的2种
2.比较3种病毒表达系统
（1）腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒载体包括（穿梭质粒、骨架质粒）、（提供E1蛋白的包装细胞293细胞）
（2）慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。
（3）逆转录病毒载体:逆转录病毒不但感染效率高,而且通常不会导致寄主细胞的死亡,被它感染的或转化的动物细胞能够持
续许多世代,保持正常生长和保持病毒感染性的能力。
3.转染效率的检测方法：
1.流式细胞术
2.免疫荧光:通过DNA产物荧光标记检测
3.Western blotting：：检测目的蛋白的表达
4.qPCR：如基因沉默的检测
4.细胞稳定筛选的筛选：
细胞筛选抗性：新霉素/G418 (Neomycin)
5.影响细胞转染的因素：
（1）细胞状态 （2）血清 （3）DNA质量 （4）转染技术和试剂
6.贴壁细胞和悬浮细胞进行转染时最合适的细胞密度分别是？
解析：用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2×106-4×106细胞/ml时效果较好。确保转染时细胞没有长满或处于静止期。因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。
7.脂质体转染时存在血清时转染效率较低的原因及解决方案
解析：使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。 这些转染试剂要求在转染前换无血清培养基，转染后4-6h在更换成有血清培养基，这其实是为了减轻转染造成的细胞毒性。
8.转染（transinfection）：
转染技术(transfection)是：指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术
9.DEAE-葡聚糖法的原理和应用
（1）DEAE-葡聚糖法 ：它是一种阳离子聚合物，可以与带负电荷的DNA和蛋白质结合，进而被细胞吞噬。 聚合物浓度、核酸或蛋白质与聚合物的比值，以及转染的持续时间是重要的优化参数，另外，此方法对附着细胞的转染非常有效，也可用于某些悬浮细胞系。 缺点是一些细胞类型对葡聚糖特别敏感，可能会发生形态变化或者抑制细胞生长。
（2）采用DEAE-葡聚糖法进行外源DNA转染时，为了提高转染效率，可以加入（ ），处理后效率会增加，是因为其可以抑制溶酶体水解酶降解DNA。使用（）或（）对细胞进行休克处理，也会使得某些细胞转染效率大大提高，但应注意暴露太久会有毒性。DEAE-葡聚糖法不适合于稳定转染，转染时要除掉（ ）
10.采用Nucleofector时，细胞转染效率越高，细胞存活率越低，可以转染原代细胞
解析：Nucleofector可以直接将DNA转染到细胞核内，因此实现了因受到细胞分裂限制而一直困扰人们的原代细胞的高效率转染。在 Nucleofector核酸转染仪的帮助下，您可以在肿瘤研究、免疫学、组织工程学及心血管疾病研究领域中轻而易举地获得大于90％的高效率基因转染率。Nucleofector 核酸转染技术特别适用于转染原代细胞和难以转染的细胞系，如T细胞及PC-12细胞系等。
11.显微注射法（microinjection）：
显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组（rearrangement）、缺失（deletion）、复制（duplication）或易位（translocation）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内
第2课：基因沉默技术
- 基因沉默技术的概念
基因沉默技术 是指：从DNA或者RNA水平抑制基因表达的技术 - 主要基因沉默技术及分类
2.1. 基因打靶技术
（1）同源重组(homologous recombination):是将外源基因定位导入受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修修正缺陷基因的目的。
（2）位点特异性重组:发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需序列特异性位点attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。
（3）基因打靶是利用DNA同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段 包括基因敲除（gene knock out）和基因敲入（gene knockin））
（4）基因打靶的步骤：
1.构建打靶载体 2.将载体载入 ES 细胞 3.将基因敲除ES细胞注射入胚泡合胚胎。
4.植入子宫 5.获取子代小鼠 6.筛选的杂合小鼠繁殖 7.筛选获得子二代
2.2 反义寡核苷酸技术
1.反义寡核苷酸：
2.3. 锌指核酸酶技术和TALEN技术
1.锌指酶技术：效率 1-20%
2.TALEN技术:
3.CRISPR-Cas系统：
1.概念
2.步骤：
（1）PAM旁间隔序列的获得 （2）pre-crRNA的转录与加工 （3）CRISPR-CAS系统对入侵核酸切割
2.4. RNAi技术
3. RNA干扰技术
3.1.RNA干扰的概念：
3.2 RNA干扰的机制：
3.3 RNA干扰的特征：
3.4 siRNA的制备方法（优缺点）
复习题
1.基因沉默技术：
基因沉默技术 是指：从DNA或者RNA水平抑制基因表达的技术
2.同源重组（homologous recombination）
是指发生在非姐妹染色单体（non-sister chromatid) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD。
同源重组可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子，后者又被称为基因转换（Gene Conversion)。由于同源重组严格依赖分子之间的同源性，因此，原核生物的同源重组通常发生在DNA复制过程中，而真核生物的同源重组则常见于细胞周期的S期之后
3.位点特异性重组site-specific recombination
位点特异性重组不仅需要一段同源序列（又称为附着点，att），同时需要有位点特异性的蛋白因子（重组酶）参与催化过程，但不需要RecA蛋白的参与。由于这些蛋白因子不能催化其他任意两条同源或非同源的DNA片段间的重组，因而保证了重组的高度专一性和高度保守性，所以这类重组又称为保守重组(conservative recombination)。例子：λ噬菌体编码λ整合酶（integrase）。
4.基因打靶技术
基因打靶是利用DNA同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段 包括基因敲除（gene knock out）和基因敲入（gene knockin））
5.反义寡核苷酸
6.锌指核酸酶（ZFN）中的DNA识别结构域由一系列Cys2-His2（锌指蛋白）串联组成，一般是3-4个，每个锌指蛋白识别并结合1个特异的三联体碱基，并带有非特异性核酸内切酶（ FokI ），该酶只有2聚化后才具有切割活性。锌指核酸酶的特点是效率高：传统的基因敲除技术依赖于细胞内自然发生的同源重组，其效率只有10-6，而锌指核酸酶的基因敲除效率能达到（ 1-20% ）。可以构建knockout细胞、周期短；但价格上没有优势。
7.TALEN（转录激活子样效应因子核酸酶）是一种人工核酸酶，由（ TALE ）和（ 核酸酶 FokI ） ）构成，是用于定向基因打靶的一种新技术。
8.CRISPR-Cas系统发挥作用的3个阶段是：
（1）PAM旁间隔序列的获得 （2）pre-crRNA的转录与加工 （3）CRISPR-CAS系统对入侵核酸切割
9.CRISPR -Cas 系统对靶序列的切割只需要tracerRNA、pre-crRNA 、Cas9 、RNaseIII 4种成分，故而被人们进行改造成对哺乳动物基因组DNA进行靶向修饰的工具，在哺乳动物细胞中，其内源性（CAS9 ）可以代替细菌RNaseIII的作用，因此不需要人为向细胞中导入。为了进一步简化操作过程，根据crRNA与tracerRNA的结构特征，设计出模拟二者结合后形成的二聚体结构（ sgRNA/ gRNA ）。
10.RNA干扰技术：
11.siRNA设计的原则有哪些？
12.siRNA制备的方法中可以进行抗生素筛选，用于长效抑制的的是（ siRNA表达载体）。
13.siRNA转染细胞的目前用的较多的常用方法是（ 脂质体转染法 ）。
14.siRNA的应用：
1.·基因沉默的工具 RNAi文库的构建
2.病毒性疾病的治疗 遗传性疾病的治疗 肿瘤的治疗
3.抑制黑色素瘤侵袭 瘢痕疙瘩
4.线虫表型筛选模型 药物筛选中基因靶位点分析
15.RNA干扰存在的问题：
第3课：细胞培养
1.细胞培养的基本条件
（1）无菌条件
（2）细胞生长条件
（3）细胞检测条件
（4）细胞保存条件
2.细胞培养的基本技术
（1）无菌操作技术
（2）培养细胞的观察
（3）体外细胞的培养
（4）培养细胞的污染和检测
3.特殊细胞培养
（1）原代细胞培养技术
（2）肿瘤细胞原代培养技术
（3）大规模细胞培养技术
（4）一些常见的细胞系
复习题
1.细胞培养：
2.净化工作室是基于无菌条件下进行细胞培养的场所，设计标准为 ，微生物最大允许数沉降菌
个/皿，专供细胞培养、冻存以及细胞治疗用。
3.细胞培养间cell culture room 一般由 、 、 三部分组成，使用前紫外照射30 - 60 分钟，每周乳酸、过氧乙酸熏蒸2小时，每月（ ）擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。
4.高压灭菌锅适用于耐高温、高压 材料的灭菌，（ ）灭细胞培养基。
5.消毒和灭菌的区别：
6.湿热灭菌在（ ）下彻底杀灭细胞芽孢，烘箱（ ）主要用于玻璃器皿的灭菌。
7.CO2培养箱的设定条件为（ ）。
8.实验室用水的3个等级：一级水是用二级水经过石英设备蒸馏或离子交换混合床处理后，再经过0.2um微孔滤膜过滤来制取，用于有严格要求的（ ）如高压液相色谱用水。二级水可能含有微量的无机、有机或胶态杂质，可用多次蒸馏、离子交换方法制备，二级水主要用于（），如原子吸收光谱分析用水。三级水适用于（ ），可用蒸馏、离子交换等方法制取。
9.常用的pH平衡液溶液有（ ）、（ ）、（ ）维持渗透压。
10常用的pH调节液（ ）、（ ）。
11.胶原酶溶液和胰蛋白酶溶液作用的不同比较？
（1）主要作用：
（2）是否受Ca2+、Mg2+、血清抑制：
补充：常用的细胞消化液有（ ）、（ ）、（ ），对于一些贴壁特别牢固的细胞，可以采用（ ）联合消化法
12.常用的抗生素双抗溶液是（ ）和（ ）。
13.合成培养基：
14.贴壁细胞培养用（ ）培养基，悬浮细胞培养用（ ）培养基。
15.（ ）培养基原为小鼠成纤维细胞设计，现广泛用于贴壁细胞培养；（ ）培养基专为淋巴细胞设计，现在广泛用于悬浮细胞培养。
16.血清消除采用（ ），血清的灭活是为了消除（ ），一般条件是56℃，30min .
17.血清的解冻采用逐步解冻法，先从-20℃或-70℃转移至（ ）融解1天，至室温下全溶后再分装，不要直接从-20℃转移至37℃解冻，其原因是（ 因温度改变太大，容易造成 ）。
18.由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，加有谷氨酰胺的培养液在4°冰箱储存2 week 以上时，应（ ）。
19.培养细胞的观察方法有（ ）、（ ）
20.体外培养细胞常见问题的解决方法：如培养细胞不贴壁，可能的原因有（ ）、（ ）、（ ）。
21.培养细胞的一代生存期：
补：培养细胞的一代生存期包括（ ）（ ）（ ）。
22.传代培养的原因：
23.根据细胞生长的特点，细胞传代的方法有3种，其中对于悬浮生长细胞传代采用（ ）；对于半悬浮生长细胞传代（如Hela细胞）采用（ 直接吹打法 ）；而对于贴壁生长细胞传代则采用酶消化法传代，如采用胰蛋白酶，其常用浓度为（ ）。
24.贴壁生长细胞传代方法：①吸光培养液 ②胰蛋白酶液清洗 ③加入培养液中止消化 ④用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打（ ），形成细胞悬液 ⑤离心，细胞（ ）用培养液制成细胞悬液；⑥吸取一定量的细胞悬液，接种于新的培养瓶内 ⑦加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。⑧放入培养箱中过夜培养，观察细胞贴壁和生长状况。
25.细胞计数的最适浓度是（ ）。
26.细胞冻存和复苏的原则及其原因：
27.细胞冻存时，加入低温保护剂，能大大提高冻存效果，常用的低温保护剂是（ ），它是一种渗透性保护剂，作用是：
28.细胞冻存液的配方：70%细胞培养基+（20%的 ）+（10%的 ）。
29.细胞慢冻标准程序：-25℃以上 1-2℃/min -25℃以下 5-10℃/min -100℃ 迅速放入液氮中。
30.培养细胞受细菌污染后，会出现（ ）、pH（ ），污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
31.培养细胞受真菌污染后，在培养液中会（ ），有的散在生长，培养液一般（ ），倒置显微镜观察可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
32.培养细胞受到支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖（ ），部分细胞变圆，从瓶壁脱落，但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
☆支原体污染后采用抗生素处理，有效的抗生素是四环素、大环内酯，还可以采用MRA mycoplasma removal agent
如果采用离心，结合抗生素四环素处理可以达到更好的效果
33.从原代猴肾细胞中已发现不少于20种血清性病毒污染。
34.（ ）是防止细胞在培养过程中发生污染的最好办法。
35.原代培养（primary culture）：也称为（ ），即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周，完成从体内环境到体外环境的过渡和适应过程，恢复了（ ）与（ ）的能力。
36.原代细胞的特点：①（ ） ②细胞群是异质的：（ ） ③（ ）④（ ）。
37.原代细胞培养的重要意义？
38.原代细胞培养针对不同的样品来源有不同的处理方式，如果是血液、羊水、胸水或腹水，常采用（ ）的方法。如果是实体组织材料，为了使组织中的细胞充分分散，细胞细胞悬液，可以采用（ ）、（ ）、（ ）。
39.淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞分离纯化的常用试剂，常用的淋巴细胞分离液有（ ）、（ ），它们2种淋巴细胞分离液在分离单个核细胞采用的方法均为（ ）。
40.采用Ficoll淋巴细胞分离液分离血液，淋巴细胞层和单核细胞层位于（ ）。
41.血管平滑肌细胞采用（ ）培养。
42.原代细胞纯化方法中，如培养恶性肿瘤细胞，可以采用（ ）建立细胞系；如果是一般原代细胞的纯化，可以采用（ ）、（ ）、（ ）以及流式分选的方法。
43.体外培养肿瘤细胞的3个显著特征是（ ）、（ ）、（ ）。
44.排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键，可以采取①（ ）②（ ）③（ ）④（ ）。
45.体外培养肿瘤细胞生物学检测的检测方法主要有①（ ）、（ ）、（ ）、细胞骨架电镜观察。
☆癌细胞原代培养成功的关键在于①取材 ②成纤维细胞的排除 ③选用适宜的培养液和培养底物等
46.动物细胞大规模培养技术（large-scale culture technology） 细胞生物反应器 高密度大量培养 ☆
47、常见的细胞系中肿瘤细胞EL4是（ ），B16是（ ）。
48、K562细胞系慢性髓原白血病属于（悬浮细胞）
第4课：流式细胞术
1.流式细胞术：是以高能量激光激光照射高速流动状态下被 照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或颗粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）进行快速多参数定性或定量检测和分选的一种细胞分析技术
2.流式细胞仪：Flow Cytometer以流式细胞数为理论基础，激光技术、单克隆抗体、细胞荧光化学和计算机等学科知识为一体的高科技 细胞分析仪。
3、流式细胞术最大的特点（优点）：
4.流式细胞仪的组成：
·液流系统 流动室与液流驱动系统：聚焦细胞以供检测
·光学系统 激发和收集光信号 聚焦缩小的激光束，有效地激发细胞所携带的荧光素，使细胞的所有信息能够完全显现出来。
·电子系统 将光信号转化为电信号，并使其数字化以供计算机分析
·细胞分选系统
5.流式细胞仪能给予的细胞参数：
（1）相对大小 前向散射光(forward scatter, FSC)：
（2）相对颗粒度密度等内部结构属性 侧向散射光（side scatter, SSC)
（3）相对荧光强度 用于从非均一群体中鉴别处某些亚群
6.操作流程
（1）获得单细胞悬液 （2）封闭 （3）荧光标记/对照设计 （4）流式细胞仪检测 （5）性质测定、细胞分析
（1）样品要求：单细胞悬液，样品至少20000个细胞，最适合浓度：
（2）封闭：为什么要封闭？封闭以消除非特异性染色，提高目的蛋白的准确性和降低背景
（3）·荧光素的选择；抗体的选择（荧光抗体的选择，怎么选择，设置参数，荧光抗体选择注意事项，多色荧光搭配的原则）
·对照设计：①空白对照（本底荧光对照）②同种型对照 ③补偿对照 ④阳性对照
FACS荧光激发细胞分选 -流式细胞分选对照的设计：
1.空白对照 (negative control) 自发荧光/本底荧光对照 未染色的细胞 空白对照：不进行任何标记的细胞，主要目的是用于测定基础荧光信号表达值。
2.同型对照：使用同种型抗体做平行实验，主要目的是消除抗体与样本的非特异性结合而产生的背景。
3.荧光补偿对照：当多种荧光被单波长激发时，荧光发射光谱会产生重叠，为纠正荧光光谱重叠-Compensation controls细胞样本分别用单独的荧光抗体染色 (Compensation controls)，来决定荧光重叠的水平，确定适合补偿
4.阳性对照：一般会使用已知的高表达目标抗原的细胞做平行实验，主要目的是排除实验中实验方法、试剂、操作等实验的影响因素。
7.FCM设门法：
用门选择某用门选择某一或某些特性（荧光特性或散射光特性）的细胞 对门内的细 细胞，对门内的细胞群体作进一步的分析 它是定性细分析，它是定性细胞亚群的重要方法。
8.数据展示方法：
·plot
9.流式细胞仪细胞分选
是一种分离异质性细胞群的方法，当经过荧光染色或标记的单细胞悬液放入样品管中，在流动室中排成单列，细胞在喷口处充以正、负不同的电荷，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，没有充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
优点·单个细胞的分选 ·基于细胞表面标志物分选
·基于细胞内标记物的分选（例如GFP） ·通过多个标记物可以分离复杂细胞类型且纯度要求高。
第5课 显微镜技术与方法
1.显微镜基础
（1）The Point Spread Function点扩散函数 对光学系统来讲，输入物为一点光源时其输出像的光场分布，称为点扩散函数。
（2）Convolution 卷积
（3）Resolution 分辨率
（4）Brightness 亮度？
（5）Signal to Noise Ratio信噪比
2.共聚焦显微镜
3.超分辨显微镜
4.电镜
1.点扩散函数：对光学系统来讲，一物面点光源通过光学系统所成的像的三维光强分布，称为点扩散函数（PSF）。
2.卷积：把1个信号叠加到另外1个信号上，形成最后的混合信号
去卷积：从混合信号中，知道其中1个信号，求出另外1个信号。
3.分辨率 resolution：R = 0.61 λ / NA ，NA值越高，显微镜价格相对（ 较高 ），NA（数值孔径） = n ·sinα ，换用油镜，会提高α，因此显微镜的分辨率会提高。
4.显微镜的亮度：在NA值一定的情况下，随着放大倍数增加，亮度会（ ）。在荧光显微镜中还与（光强度）和（荧光基团量子产率）有关。
5.SNR是（ ）的缩写，它用于成像图像的质量。
6.相差显微镜：
7.滤光片的作用：是用来选取所需辐射波段的光学器件。
8、共聚焦显微镜：以激光为光源，由共聚焦成像扫描系统、电子光学系统和微机图像分析系统组成。光束经聚焦后落在样品(组织厚片或细胞)不同深度的微小一点，并作移动扫描，通过电信号彩色显像，可使样品内任何一点的反射光形成的图像，都被准确地接收下来并产生信号，传递到彩色显示器上，再连接微机图像分析系统进行分析处理。
9、激光扫描显微镜和 spinning-disk confocal“转盘式共聚焦”的区别
·转盘式共聚焦是一种用于提高光学分辨率和对比度的显微光学图像增强技术
激光扫描显微镜的优点是（ ） 、区域可以选择，可以做荧光漂白恢复，缺点是速度很慢
转盘式共聚焦显微镜的优点是（ ），缺点是由于pinhole之间的信号交联，信噪比很低，不能够对感兴趣的区域选择。
10、共聚焦显微镜的用途有（ ）、用于（ ）、用于（ ）、用于（ ）、用于（ ）
注：激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)是在荧光显微镜成像基础上配置激光光源和扫描装置，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦装置，利用计算机进行图像处理，对观察样品进行断层扫描和成像，是一种高敏感度与高分辨率的显微镜，在生命科学领域的组织、细胞 和分子水平研究中的应用十分广泛，主要用于样品荧光定量检测，共聚焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和细胞间通讯等方面研究。
11、荧光漂白恢复可以测定标记分子在活体细胞表面或细胞内部的运动及其迁移速率。
12、超分辨率显微镜
缩写 中英文全称 分辨率 特点
TIRF Total internal reflection fluorescence microscopy
全内反射荧光显微镜 100 - 200 nm 优点是荧光背景小，信噪比高
SIM Structured Illumination Microscopy
结构光 照明显微镜 约 100 nm 光源是结构光
STED stimulated emission depletion microscopy
受激辐射损耗 显微术 约 20 nm 采用面包圈照明，有激发光和损耗光两束光源，缺点是对样品损伤度很大
PALM and STORM 约 20 nm 缺点是因为要对分子中心进行定义，需要大量的计算
MINFLUX 1 nm minflux是借鉴两者技术sted以及 palm和storm，取二者的优势，充分利用光子，所以名字叫minflux
12、电镜技术和光学显微镜技术的不同：
电镜 光学显微镜
光源 电子束 可见光
光镜聚焦镜 电磁透镜 光学棱镜
成像系统 荧光屏、底片、CCD 凸透镜放大
成像机制 相位衬度 振幅衬度
分辨率 nm，亚显微结构 um，显微结构
样品要求 真空成像，厚度50 -80 nm左右 切片厚度 3- 5 um
第6课 细胞增殖和细胞凋亡检测技术
1.细胞增殖检测技术
（1）直接观察 （血球计数板计数的最适浓度）
（2）DNA合成检测：3H-TdR 、Brdu （需要DNA变性） 、Edu（无需DNA变性，检测染料Apollo很小）
（3）增殖相关蛋白： Ki67（核增殖标志物）、PCNA（增殖细胞核抗原，DNA聚合酶δ辅助蛋白）、CFSE法（轻易穿透细胞膜，在胞内水解后发出绿色荧光，荧光强度随细胞分裂会一半递减）、CTV（毒性小，但占用了DAPI通道）
（4）细胞活力检测：MTT（黄色MTT还原成兰紫色不溶于水甲瓒formazan颗粒）、CCK8（还原橙黄色甲瓒formazan颗粒）、毒性检测LDH法（释放的LDH会将无色WST还原成橙色甲瓒产物）
2、细胞凋亡相关检测
形态学检测：Hoechst染色-核染色质变化、细胞凋亡过程根据细胞核染色质形态学变化分为3期：I期褶缝样；IIa高度凝集边缘化，IIb细胞核染色质断裂为碎片，形成凋亡小体
（1）凋亡最早期的事件：Caspase-3酶原的激活： western blot
（2）凋亡中期的事件是线粒体膜电位的丧失和细胞色素c的释放、细胞膜PS外翻。
①线粒体膜电位检测：JC-1荧光染料
②细胞色素c释放：Cytochrome c apoptosis assay Kit 进行western blot
③细胞膜PS外翻：Annexin V染色/ PI染色结合 、AnnexinV/7-AAD结合
（3）凋亡中晚期的标志是DNA ladder的产生、晚期事件是凋亡小体的形成。
DNA ladder 、细胞膜通透剂流式细胞分析术产生亚二倍体峰、TUNEL
复习题：
1.细胞分裂的方式有（ ）、（ ）、（ ）。
2.蛙的红细胞进行（ ）。
3.细胞周期：
4.细胞血球计数板计数细胞最适合浓度为（ ）。
5.3H-TdR掺入法：利用3H-TDR可以作为DNA合成的前体掺入DNA合成的代谢过程的原理，通过检测细胞的放射性强度，可以反映细胞的DNA代谢以及增殖情况的原理，利用（ ）接受3H-TdR放射出的β射线，将其转换成荧光光子，荧光光子被光电倍增管接受转换以脉冲信号形式输送出去，脉冲的数值指示了样品中放射性的强弱。
6.BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，可以代替胸腺嘧啶在（ ）被掺入到DNA双链中，可以利用Brdu专一性抗体，显示增殖细胞。但由于Brdu专一性抗体分子太大，无法直接与DNA中的BrdU结合，要对DNA进行（ ）
这就（ ）。影响了其他染料的结合染色，导致染色弥散，准确性降低等问题。
7.EdU也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，它也能够在S时期代替胸腺嘧啶（T）掺入正在复制的DNA分子，基于EdU能够与（ ）特异性反应，通过检测荧光值检测DNA的复制活性，从而准确地反映细胞增殖情况。相比BrdU,Edu的优点是
8.增殖细胞核抗原（ ）是1983年Gerdes发现的在增殖细胞中表达的1种核抗原，是目前较为肯定的（ ），只在增殖期（ ）表达，G0期缺失，与细胞有丝分裂密切相关，预示将进入分裂期的细胞数目，它在细胞有丝分裂过程中维持（ ），在多种恶性肿瘤中（ ），其表达水平可以用于评价细胞的增殖状态、肿瘤的生物学行为。
9.PCNA增殖细胞核抗原由Miyachi于1978年在SLE（系统性红斑狼疮）患者的血清中首次发现并命名，由于PCNA出现在增殖期细胞的细胞核中，所以被称为增殖细胞核抗原，PCNA是DNA聚合酶（ ）的辅助蛋白，参与DNA的复制，参与细胞周期调控，同时还参与DNA损伤的修复。
10.Ki67 vs PCNA
11.CFSE检测细胞增殖的原理：
12.CTV检测细胞增殖的原理
13.CTV与CFSE检测的比较
14.MTT检测法的原理：
15.MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存2周内有效或者配置成5mg/mL保存在-20°长期保存，避免反复冻融。
16.Cell Counting Kit-8是一种基于WST-8的用于细胞增殖和细胞毒性的快速高效 灵敏度检测方法，CCK-8细胞活性检测中，WST-8可以被线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒产物，测定OD450的光吸收值，可以间接反映活细胞数量。
17.CCK-8法与MTT法比较：
CCK-8法的优点：
18.利用LDH法检测细胞毒性，如果细胞受损，受损细胞释放的LDH可以催化乳酸生成丙酮酸和NADH，NADH通过电子载体可以将无色的水溶性四唑盐WST还原成橙色的甲攒产物，甲攒产物的吸光度与LDH的量呈正比，因此可以测定死细胞和受损细胞的数量。
19.细胞死亡根据形态和结构可以分为哪些种类？
20.程序性细胞死亡（PCD）:
21.凋亡最早期的事件是（ ）；细胞凋亡中线粒体被激活的2个最显著特征是（ ）和（ ）；（ ）紧随着细胞线粒体膜电位的丧失而发生，是细胞凋亡中期最明显的标志；核碎片的形成以及DNA（ ）是细胞凋亡中晚期的标志性特征。
22.凋亡小体（apoptotic body）:
23.Hoechst 33342 、Hoechst 33258 ,DAPI是常用的DNA非特异性染料，与DNA结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的（ ），紫外光激发时发出明亮的（ ）。
24.细胞凋亡过程中细胞核染色质形态学的改变分为3个时期：
I期（ 细胞核呈现波纹状或呈褶缝样，部分染色质出现浓缩状态 ）
IIa期（ 细胞核染色质高度凝集、边缘化 ）
IIb期（ 细胞核裂解为碎块，产生 ）.
25.对凋亡细胞进行DNA含量分析，采用荧光染料碘化丙啶PI染色时，PI嵌入DNA双链后发出（ ）。
此外，由于发生凋亡的细胞核内DNA裂解成许多小片段，在酒精固定后，细胞原有的部分DNA丢失，剩下的大片段DNA在DNA染色后，用流式细胞分析术检测其DNA含量，会出现一个（ ）.
26.TUNEL TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling 脱氧核糖末端转移酶介导dUTP缺口末端标记法的原理
27.Annexin V染色：凋亡细胞的细胞膜表面的改变之一是（ ），使得（ ），Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，易于结合到PS磷脂酰丝氨酸的特性，对PS有高度的亲和性，可以充当探针检测暴露于细胞膜表面的PS，
28.AnexinV/PI染色的原理？
29.Annexin V / 7-AAD染色：7-AAD是一种核酸染料，具有高DNA结合常数，不能通过正常的细胞膜，而随着细胞凋亡、细胞坏死过程，细胞膜对7-AAD的通透性逐渐增加，结合细胞凋亡细胞中的DNA，在合适的波长激发光的激发下，可以发出明亮的（ ）。
30. 7-AAD用（ ）nm激发，用670/14 BP收集，与PI相比，7-AAD与PE和FITC的光谱重叠小，可以在多色分析中与PE和FITC标记的抗体结合使用。
31.如果采用Annexin V对磷脂酰丝氨酸染色的话， 由于EDTA会络合Ca2+，影响Annexin V 与PS的结合，因此应该使用不含（ ）的胰酶消化贴壁细胞。
32.多种细胞凋亡刺激因子均可以诱导不同的细胞发生凋亡，而（线粒体跨膜电位的下降 ）被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩，DNA断裂之前）。
33.线粒体跨膜电位的存在，使得一些亲脂性阳离子荧光染料，如Rhodamine123 、（ ）、TMRM等可以结合到线粒体基质。
34.线粒体膜电位的检测常常采用什么荧光染料，说明其原理？
JC-1亲脂性阳离子荧光染料检测膜电位使用较多，JC-1有（ ）和（ ）二种状态，低浓度时，以（ ）存在，可以检测到（ ）；高浓度时，以（ ）存在，可以检测到（ ）。
正常细胞：
凋亡细胞：
35.线粒体细胞色素c释放采用Cytochrome c Apoptosis Assay Kit试剂盒抽提出线粒体组分和细胞质组分，然后用抗细胞色素c的抗体进行Western Blot分析，可以看到细胞色素c由线粒体向细胞质的转位。
36.Caspase 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)。caspase是一组存在于细胞质中具有类似结构的蛋白酶。Caspase与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。
37.Caspase -3正常情况下以酶原形式32kD存在于胞浆中，在凋亡早期阶段被激活,活化的Caspase-3由2个大亚基（17 kD）和2个小亚基（12 kD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡，但在凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。采用Western blot分析caspases-3酶原的活化。
38.凋亡分析的总体原则:
（1）多指标同时检测 （2）不同的时间点进行采样 （3）设定阳性和阴性对照
39.给出一个检测细胞增殖、凋亡的具体实验方案：
（1）增殖检测：CCK-8（Cell Counting Kit8）检测法：基于WST-8可以被线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原成橙黄色的甲攒产物formazan，细胞增殖越多越快，生成的橙黄色甲攒产物formazan越多在450nm处测定光吸收值。
细胞-培养-添加CCK-8试剂-孵育-测定吸光度
（2）凋亡检测：Caspase-3酶切检测：Caspase在凋亡早期阶段被激活，活化的Caspase-3形成2个大亚基和2个小亚基，通过Western Blot进行检测：
（3）验证促进凋亡：采用TUNEL（末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法）进行检测，当细胞发生凋亡时，染色体DNA双链断裂或单链断裂会产生大量的3’-OH末端，可以在TdT作用下，将末端标记上耦联FITC的dUTP,采用荧光显微镜观察。
40.凋亡分为启动和凋亡早期、凋亡中期、凋亡晚期
凋亡最早期的事件是Caspase-3酶原的激活
凋亡中期的事件是线粒体膜电位的丧失和细胞色素c的释放、细胞膜PS外翻。
凋亡中晚期的标志是DNA ladder的产生、晚期事件是凋亡小体的形成。
第 7 课：细胞信号转导技术
1.细胞信号的传递方式
（1）细胞 & 外界环境 ：
（2）细胞 & 细胞 ：
2.细胞信号转导、意义
3.细胞信号转导通路
细胞信号的传递方式：
细胞与外界环境：
细胞与细胞之间：
1.细胞信号转导：影响细胞的生物学功能
2.细胞信号转导的意义：
3.JAK-STAT通路
Ligand-receptor-二聚体形式活化（酪氨酸激酶相互磷酸化）-STAT5-调控下游基因的表达
4…不同的信号转导通路交互作用：（TNF-α对于细胞增殖和细胞凋亡的选择）
不同的信号交叉：不同的通路导致相同的作用
5.细胞对信号的反映：
1.细胞质活性改变
2.细胞核：基因表达改变-转录出新的更多蛋白质
6.细胞信号转导的检测（方框内）
信号 - 受体 - 信号转导级联通路 -细胞核转录因子和基因 - 蛋白质表达谱 -生物学效应
（1）配体 受体 的寻找和筛选
细胞信号级联通路的检测：
化学修饰：
（1）磷酸化：功能介导细胞内信号转导，通过质谱，放射性测量分析，
（2）泛素化
（3）甲基化
（4）乙酰化
（5）糖基化
（1）磷酸化：蛋白激酶 使底物磷酸化； 磷酸酶：使底物去磷酸化
Ras-Raf（MAPK）三级级联激活
检测方法：Wetern BLot：抗体检测（特异性抗磷酸化蛋白抗体）；质谱分析法；放射性标记；激酶活性测定
Western Blot检测磷酸化蛋白-操作细节和注意事项：
1.易降解：需要加蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂 lysis buffer
2.孵育时间 磷酸化蛋白只占总的蛋白量的极少部分
3.抗体品质 磷酸化抗体的好坏
4.稀释倍数
5.磷酸化量/蛋白总量
6.出现杂带：磷酸化蛋白WB，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性条带，磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异的条带，对待marker或过表达蛋白 TAG蛋白，确定是否是正确条带
7.背景较高:曝光时间
流式细胞仪检测
没有抗体的情况下，对磷酸化进行检测
1.质谱分析 ：不依赖抗体，通量高；
操作步骤：细胞裂解蛋白抽提，蛋白水解消化，磷酸化多肽富集，磷酸化多肽质谱分析。
2.蛋白酶抑制剂：上下游基因
应用蛋白激酶/磷酸酶的抑制剂对酶的活性进行调节时进行蛋白质的可逆磷酸化：抑制剂多为小分子药物或单克隆抗体。
3.32P同位素放射性标记法
用含血清的无磷酸盐培养基冲洗细胞
泛素化：
E1泛素激活酶 E2泛素载体蛋白 E3泛素连接酶（有特异性）
正向co-ip 用目的蛋白检测泛素
反向co-ip 用泛素结合目的蛋白的方法检测目的蛋白
确定泛素化的类型：
泛素分子进行不同位点的突变
确定泛素化位点：
苏木化修饰：
SUMO-1 主要分布在细胞核核膜和有丝分裂的纺锤体上,SUMO-1主要是以底物蛋白质结合的形式存在
SUMO-2/3 主要聚集在着丝粒和染色质中，SUMO2/3则主要是以游离形式存在。
a.是否发生SUMO化：IP -WB
b.在什么位置发生了SUMO化：质谱
c.验证sumo化发生位置：突变实验
d.验证sumo化发生位置：回补实验
乙酰化修饰：Chip-seq
染色质免疫沉淀技术Ch IP:交联剂如甲醛处理细胞或组织样本，固定组蛋白与DNA复合物。然后超声。核酸酶处理染色质，产生短的DNA片段；然后针对组蛋白特定修饰的抗体，进行免疫沉淀IP的实验步骤，纯化结合组蛋白的DNA。
甲基化修饰：
甲基转移酶 DNA CG二核苷酸中的胞嘧啶被选择性地添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，5’- CG - 3’序列
RNA上的m6A的检测：最常见的RNA甲基化修饰是m6A（6-甲基腺嘌呤）在mRNA的翻译和选择性剪接，microRNA的成熟中发挥作用
蛋白质相互作用检测方法：
1、免疫共沉淀法（Co-ip）
2、酵母双杂交法系统（yeast two-hybrid system）
酵母双杂的局限性：①不能检测某些核外蛋白质之间的相互作用；②假阳性 a.某些蛋白质本身具有激活转录功能，或者可以在酵母内表达时发挥转录激活作用 b.有些蛋白质表面对其他蛋白质有低亲和力区，容易形成蛋白质复合物
为了降低假阳性：①设立正确的对照，对诱饵蛋白和靶蛋白能否单独激活报告基因做验证。②使用多个报告基因③将报告基因整合到染色体上，可以使基因表达稳定，消除由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。
酵母双杂交的新发展：
酵母三杂交：可以用于蛋白质与RNA之间的互作研究，或研究3种不同蛋白质之间的互作研究
酵母反向杂交：用于确定蛋白质间相互作用的关键位点，或起决定作用的个别氨基酸、特定结构，报告基因的表达产物对细胞生长有抑制作用，这样当诱饵蛋白与靶蛋白存在相互作用时，表达出有毒性的报告蛋白，细胞不能生长，通过突变某些位点来确定蛋白间相互作用的关键位点。
核外双杂交：36℃ cdc25-2基因温度敏感性突变的酵母菌株内，由于该菌株中cdc25-2基因编码的EGF蛋白在36℃下不能激活细胞膜上的Ras蛋白，Ras途径不通，所以细胞在36条件下无法生存。但是如果待测蛋白X与Y之间发生相互作用就能把EGF蛋白带到细胞膜上并激活附件的Ras蛋白，从而打通Ras途径
待测蛋白X与Sos蛋白融合，Y蛋白与锚定在酵母细胞膜上的Src肉豆蔻烯化信号蛋白融合
核酸与蛋白质相互作用：
1.EMSA electrophoretic mobility shift assay 凝胶电泳中，在电场作用下，裸露的DNA朝向正电极移动的距离与其分子质量的对数成反比，如果DNA与蛋白质结合后，由于分子质量增加，它在凝胶中的迁移便会受到阻滞，因此在特定电压和时间内朝向正电极移动的距离也会相应缩短。
2.染色体免疫共沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay ,CHIP）在活细胞状态下固定蛋白质 - DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段纯化检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
3.RNA免疫共沉淀 RIP ：
荧光能量共振转移FRET: 蛋白和蛋白之间的相互作用
双分子荧光互补：BiFC（体内-体外检测蛋白质相互作用的技术）将荧光蛋白在合适位点切开，形成不发光的2个多肽，随后将2段多肽分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，如果诱饵蛋白和捕获蛋白之间存在相互作用，那么2段多肽片段会重新靠近形成有活性的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时能产生荧光。
Biacore技术：表面等离子体共振技术SPR:将1种生物分子即配体（蛋白、抗体）偶联在生物传感器表面，再将含有另一种能与靶分子产生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流经生物传感器表面，生物分子间的结合能引起生物传感器表面质量增加，导致折射率的变化，通过监视SPR的角度变化，可自动获取分析物的动力学结合和解离常数。
第 8 课： 单细胞技术
1.异质性：单细胞技术是为了解决传统研究方法在多细胞水平会丢失细胞间异质性的信息而出现的。
2.单细胞分离与文库制备:
（1）Smart-seq (Switching mecanism at 5’ end of the RNA transcript)
（2）10 × Genomics
（3）BD Rhapsody
3.单细胞测序分析方法
（1）亚群分类和注释
（2）亚群比例分布
（3）表达量分析
（4）表观遗传图谱
4.单细胞测序 -Ab seq （or featured barcode）：转录组与蛋白表达水平的不一致性
（1）BD Rhapsody -AbSeq assay
（2）质谱流式 -CyTOF
（3）光谱流式
5.单细胞质谱-代谢组学
电生理膜片钳能将玻璃微电极接触并吸附在细胞膜上，高阻抗封接后将膜打穿成孔，记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。
电喷雾技术主要是利用一个高压交流电使分析物被离子化然后被质谱检测，该离子源具有较强的抗干扰能力。传统的质谱方法相比，这一新方法最大的优势是可以原位对活细胞进行取样，并且同时采集细胞位置、电生理活动以及细胞内化学成分等多方面的信息。
复习题
1.Smart技术是基于高保真的反转录酶、模板转换和前置放大来增加cDNA得率，实验流程2天，得到的是全长转录本。该方法有较好的覆盖范围，可检测到稀有转录本，不需要额外的专业设备，因此应用范围较广。
特点：成本高，通量低，测序质量好
2.Smart-seq单细胞分离流程：
（1）利用流式分选仪分离单细胞
（2）96孔板中加入细胞裂解液，进行细胞裂解。
（3）利用反转录进行一链的合成：使用了特殊活性反转录酶，在cDNA链的3’端加上3个C。
（4）mRNA模板置换，进行二链的合成：使用了TSO（template-switching oligo）引物合成了cDNA的二链，从而置换了与一链cDNA互补的RNA。
（5）cDNA扩增：添加ISPCR单引物用于cDNA的PCR扩增，将cDNA量扩增至ng级。
（6）标记：利用改造后高活性的Tn5转座酶对DNA进行打断的同时将接头添加到cDNA的两端，标记完成后的DNA片段通常在200 - 600 bp。
（7）PCR富集及上机测序：在进行PCR扩增后，上机测序。
3.单细胞测序面临哪些挑战，如何解决这些问题？
4.10 × Genomics单细胞文库构建：
（1）凝胶微珠是16nt的barcode +UMI序列（Unique multiplex index）+poly dt序列
（2）单细胞悬液的制备：制备成油包水的小液滴Gem（Gel bead in emusion）
（3）在得到乳浊液之后，把细胞膜破掉，让细胞当中的mRNA游离出来，mRNA与凝胶珠上的DNA分子相结合，在逆转录酶的作用下，逆转录出cDNA，得到含有cell barcode 和mRNA UMI的cDNA.
（4）文库扩增：把cDNA分子都加上接头，经过PCR扩增，做出illumina的测序文库。
5.如何知道哪些序列是来自于哪个细胞的？
通过cell barcode，每个beads上都有着相同的Cell barcode,而beads与beads之间的cell barcode是不同的，假设每个beads只捕获了1个cell，那么每个cell都被cell barcode 单独标记了。
6.如何保证每个bead只捕获1个细胞
第一是通过控制细胞和beads的流速
第二是beads的数目圆圆超过cell的数目，即绝大多数的的beads都是空的，只有少数捕获到了cell
最后，如果有个别的droplet里面有2个或者更多的细胞，通过QC进行去除。
7.BD PhapsodyTM单细胞分析系统
BD phapsodyTM 单细胞分析系统包括3部分 BD Rhapsody卡式芯片 、BD Rhapsody 上样台 、BD Rhapsody扫描仪。来自1个单细胞的mRNA带有相同的CL（cell label），来自同一个单细胞的不同转录本带有不同UMI.
8.在进行数据质控和数据过滤后，单细胞数据分析的第一步是（ ），分群基本原理是利用（ ），计算各个细胞间表达模式的差异度，然后基于一定的标准将所有细胞归为多个亚群（差异值小于特定值的细胞归为1个亚群）。亚群的分类结果的展示，经常采用（ ）的方式。
9.亚群分好之后最重要的一步是对亚群进行（ ）。通过结合细胞类型marker基因。细胞类型注释软件和文献数据做比对的方法综合进行注释。
10.假时间轨迹分析（Pseudotime 分析）是通过构建细胞间的（ ）来重塑细胞随着时间的变化过程，可以根据具体的分类分析和复杂程度，分为（ ）和（ ）。
11.Abseq和传统流式有什么不同？
Abseq 利用（ ）作为抗体的标签，用于细胞表面蛋白胨鉴定，传统的流式利用荧光基团的荧光类型进行细胞表面蛋白的判断。
12.质谱流式-CyTOF质谱流式细胞仪采用（ ）（通常是金属元素标记的特异抗体或染料）标记或识别细胞表面和内部的信号分子，然后利用流式细胞仪原理分离单个细胞，再用感应耦合等离子质谱（ICP-MS）观察单个细胞的原子质量谱，将原子质量谱的数据转换为细胞表面和内部信号分子数据，通过专业分析软件对获得数据进行分析，从而实现对细胞表型和信号网络的精细观察。
13.成像质谱流式的概念和优缺点
固态的组织切片 激光消融 经过带有同位素的抗体或者探针标记的组织切片的一部分变为等离子态，送入流式质谱进行分析， 当整个组织被扫描完之后，可以获取每个点的信息，并以此为依据重构整个组织的图像。
14.光谱流式细胞术是一种基于常规流式细胞术的技术，其中光谱仪和多通道检测器CCD代替了常规系统中的传统反射镜，代替了常规系统中的传统反射镜，滤光器和光电倍增管PMT.常规流式细胞术收集信号是采用滤光片逐步收集不同波长区间的信号，光谱流式收集（ ），通过（ ）上的光学解析探头，将光谱切开，最后根据不同荧光素的波形特征，识别出信号读取强度。
第 9 课：干细胞与组织工程
1.再生医学 regenerative medicine
2.干细胞 stem cell
3.干细胞的增殖特征包括（1）（ ）：增殖缓慢，机体需要时进入（ ）；（2）（ ）：稳定增殖，是区别于肿瘤细胞的本质特征，干细胞会维持自我更新中自身数目的恒定，干细胞维持自稳性的机制是（ ）。
4.什么是干细胞的不对称分裂？
5.干细胞按照发生学来源（发育阶段）分为（ ）、（ ）。
6.干细胞按照分化特征，即是否有全能型或多潜能性分为（ ）、（ ）、（ ）。
7.干细胞按照分化特征分为哪几类，它们各有什么特点？试举例。
8.胚胎干细胞
9.ES细胞具有早期胚胎细胞的特性：如
（1）形态特征：
（2）生化特征：
（3）功能特征：全能性
（4）ES细胞具有细胞系的特征：在饲养层上能维持未分化状态并实现自我更新
10. 1998年 Thomson建立了第一株（ ），现在获取具有胚胎干细胞全能性的细胞的方式有2种，它们是（ ）、（ ）。
11. 2012年诺贝尔生理学奖 约翰—戈登利用非洲爪蟾，体细胞核转移进去核的卵细胞中，成熟的融合细胞以及其子细胞具有发育成1个完整个体的潜能。（ 体细胞核转移 ）
12.中国克隆第一人：（ ）1963年首次完成了鲤鱼的核移植实验，成功获得了健康的鲤鱼。
13.2012年诺贝尔生理学奖：（ ）通过将4个转录因子（ ）、（ ）、（ ）、（ ）导入高度分化的小鼠成纤维细胞中，获得了iPS cell。
14.（ ） 能够维持ES细胞未分化的状态并促进其增殖，因此认为（ ）的活化是重编程为多能干细胞的标志。（ ）是ES特异性转录因子，是体细胞重编程所必须的基因。
15.成体干细胞 adult stem cells 又称为组织干细胞，是存在于成体组织的未分化细胞，具有自我增殖更新能力和多向分化潜能。
16.干细胞横向分化的概念：
17.ES cell 和成体干细胞的异同：
（1）来源（2）分化能力（3）更新能力
（4）应用 （5）是否致瘤 （6）免疫排斥反应是否能避免 。。 （7）伦理
18.造血干细胞移植 hematopoietic stem cell transplantation：
19.HSC T造血干细胞移植分类，根据供者分类，HSC移植可以分为（ ）、（ ）、（ ）：
20.造血干细胞采用免疫吸附法进行分离鉴定时，磁性标记是（ ）
21.人类白细胞抗原HLA相当于MHC. HLA配型：
22.间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell,MSC）
23.间充质干细胞具有（ ）、（ ）、（ ）特性
24.神经干细胞neural stem cell NSC:
25.神经干细胞的特点：（1）（ ）（2）（ ）（3）（ ）（4）（ ）。
26.修复缺损器官有哪些方法？
（1）
（2）
（3）
27.组织工程tissue engineering：
28.组织工程的3个支柱分别是（ ）、（ ）、（ ）。
29.组织工程的核心问题：
30.种子细胞：
31.组织工程种子细胞的3个来源：1、（ ）2、（ ）3、（ ）
32.生长因子：
33.生物材料支架：细胞外基质：
34.生物材料支架分为：（1）（ ）（2）（ ）（3）（ 1+2 ）（4）（ 生物衍生材料）
35.组织构建的方式：3种。（1）（ ）（2）（ ）（3）（ ）
36.TransCyte皮肤替代物 Carticel软骨产品
37. 3D生物打印中的生物墨是细胞 ，生物纸：生物材料，主要成分是水凝胶，可以作为细胞生长的支架
考试方式和复习建议
1.考试方式（题目类型）
闭卷考试，共3种题目类型，选择题、名词解释、问答题，合计100分，分值分布会稍有变化
题 号 选择题 名词解释 问答题 合计
得 分 40 12 48 100分
2.复习建议：
1.参考PPT对重要的内容进行理解记忆，特别是细胞凋亡和增殖的检测、细胞培养部分的PPT
2.显微镜原理、统计学考的不多，大致包括2类错误、重要的名词解释、可能会有1道大题（去年有）
3.名词解释都是很常见的
3.疑问咨询和电子版更新的地址
（1）资料更新的电子版：
请在浏览器如百度、bing搜索：CSDN 爱做饭的电饭煲，采用私信的方式交流，欢迎提问和提建议！
或直接访问：https://blog.csdn.net/qq_43337249/article/list/
（2）其他科目的资料
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