易基因｜脂多糖诱导的仔猪肝脏损伤模型中m6A RNA甲基化介导了NOD1/NF-kB信号激活
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2022年9月30日，南京农业大学动物科技学院钟翔教授团队在《ANTIOXIDANTS-BASEL》杂志发表题为“m6A RNA Methylation Mediates NOD1/NF-kB Signaling Activation in the Liver of Piglets Challenged with Lipopolysaccharide”的研究论文，该研究通过MeRIP-seq（m6A-seq）等实验揭示脂多糖诱导的仔猪肝脏损伤模型中m6A RNA甲基化介导了NOD1/NF-kB信号激活。
标题：m6A RNA Methylation Mediates NOD1/NF-kB Signaling Activation in the Liver of Piglets Challenged with Lipopolysaccharide（脂多糖诱导的仔猪肝脏损伤模型中m6A RNA甲基化介导了NOD1/NF-kB信号激活）
时间：2022.09.30
期刊：ANTIOXIDANTS-BASEL
影响因子：IF 7.675
技术平台：MeRIP-seq（m6A-seq）、RNA-seq
样本：12头处于生长阶段的雄性仔猪随机分配至两个处理组：对照（CON）组和脂多糖（LPS）组，取肝组织样本进行实验。
实验：细胞培养、siRNA和质粒转染、血清生化参数、肝细胞因子定量、肝脏组织学观察、免疫荧光、活性氧（ROS）检测、RT-qPCR、western blot、MeRIP-seq、RNA-seq
摘要：
N6-甲基腺苷（m6A）是最丰富的内部修饰，广泛参与各种免疫和炎性反应；然而其在仔猪脂多糖诱导肝脏炎症中的调控机制仍然未知。本研究在小猪腹腔注射80μg/kg LPS（LPS组）或等剂量无菌盐水（CON组）进行研究分析。结果表明，LPS处理后可提高血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性，诱导M1巨噬细胞极化，促进炎性细胞因子分泌，从而导致仔猪肝脏损伤。NOD1/NF-κB信号通路在LPS组的肝脏中被激活，且LPS处理后总m6A水平显著升高。MeRIP-seq测序分析结果显示，对照组和LPS组分别有1166和1344个转录本中m6A甲基化，这些转录本的m6A甲基化位点主要分布在5′UTR区、CDS区和3′UTR区。且这些基因主要富集在NF-κB信号通路中，LPS处理使NOD1、RIPK2、NFKBIA、NFKBIB和TNFAIP3 mRNA中的m6A修饰显著变化。此外，METTL3敲除或FTO过表达都使NOD1/NF-κB通路中的基因水平发生变化，表明该通路的激活受m6A RNA甲基化调控，且m6A RNA甲基化水平变化可能与活性氧（ROS）、HIF-1α和MAT2A增加有关。总之，LPS通过改变m6A RNA甲基化激活转录后调控的NOD1/NF-κB通路，然后促进促炎细胞因子产生，最终导致肝脏炎症和损伤。
图形摘要：LPS诱导仔猪肝脏中NOD1/NF-κB信号转导激活的m6A RNA甲基化调控机制
研究结果
（1）LPS诱导的仔猪肝脏炎症和损伤
图1：LPS导致仔猪肝脏炎症和损伤。
（2）LPS通过NOD1/NF-κB信号通路触发炎性反应
图2：LPS诱导仔猪肝脏NOD1/NF-κB信号通路被激活
（3）LPS处理后的仔猪肝脏m6A RNA甲基化图谱
图3：仔猪肝脏的m6A RNA甲基化丰度。
- ELISA检测整体m6A水平。
- RT-qPCR检测与m6A修饰相关基因的mRNA表达。
- Western Blot评估METTL3、ALKBH5和YTHDF2的肝蛋白水平，并通过ImageJ软件进行图像密度定量。
图4：CON组和LPS组肝脏转录组的MeRIP-seq。
- MEME评估LPS组的共有m6A motif。
- mRNA转录组中m6A peaks的Metagene谱。
- CON和LPS组中差异表达的m6A peaks和相关基因Venn图。
- LPS组前15个m6A修饰基因的GO富集分析。
- LPS组前15个m6A修饰基因的KEEG富集分析。
（4）NOD1/NF-κB通路受m6A甲基化修饰调控
图5：m6A RNA甲基化调控NOD1/NF-κB信号通路。
- RNA-seq和MeRIP-seq的联合分析揭示m6A修饰与mRNA表达之间的关系Venn图。
- IGV分析NOD1、RIPK2、NFKBIA、NFKBIB和TNFAIP3 mRNAs上的m6A peaks图谱。
- siControl和siMETTL3组中METTL3 mRNA的表达。
- METTL3敲除对HepG2细胞NOD1/NF-κB信号通路关键基因的影响。
- OE-NC和OE-FTO组的FTO mRNA表达。
- FTO过表达对HepG2细胞NOD1/NF-κB信号通路关键基因的影响。结果显示为用垂直条（n=3）表示SEM平均值。*代表CON组和LPS组之间的显著差异；*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。
（5）ROS、HIF-1α和MAT2A增加可能导致m6A修饰变化
图6：仔猪肝脏中ROS、HIF-1α和MAT2A的含量。
- 检测ROS含量。
- RT-qPCR检测整个肝脏中HIF-1α mRNA水平。
- RT-qPCR检测整个肝脏中MAT2A mRNA水平。
- Western Blot评估HIF-1α和MAT2A蛋白水平，使用ImageJ分析进行定量，并标准化为β-肌动蛋白。
结论：
本研究通过MeRIP-seq等实验表明m6A RNA甲基化通过调控NOD1/NF-κB信号通路激活在LPS诱导的肝脏炎症和损伤中起关键作用，揭示了通过LPS诱导的ROS、HIF-1α和MAT2A表达增加有助于提高仔猪肝脏中m6A RNA甲基化的可能性。表明NOD1和m6A RNA甲基化可能是研究和处理仔猪免疫应激诱导肝损伤的新观点。
关于易基因RNA m6A甲基化测序(MeRIP-seq)技术
易基因MeRIP-seq技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA等rRNA去除所有RNA），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量，总RNA起始量可降低至10μg，最低仅需1μg总RNA。广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域；可应用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。
大样本量m6A-QTL性状关联分析，传统MeRIP单个样品价格高，通常难以承担。易基因开发建立MeRIP-seq2技术，显著提成IP平行性，实现不同样本间相对定量，降低检测成本。
易基因提供适用于不同科研需求的MeRIP技术：
- m6A甲基化-常量mRNA 甲基化测序（MeRIP-seq）
- m6A甲基化-常量mRNA +lncRNA甲基化测序（lnc-MeRIP-seq）
- m6A甲基化-微量mRNA +lncRNA甲基化测序（Micro-lnc-MeRIP-seq）
- 高通量m6A甲基化-常量mRNA甲基化测序（MeRIP-seq2）
技术优势：
- 起始量低：样本起始量可降低至10-20μg，最低仅需1μg总RNA；
- 转录组范围内：可以同时检测mRNA和lncRNA；
- 样本要求：可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测；
- 重复性高：IP富集重复性高，最大化降低抗体富集偏差；
- 应用范围广：广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症的发生与发展、药物应答等研究领域。
研究方向：
m6A甲基化目前主要运用在分子机制的理论性研究
- 疾病发生发展：肿瘤、代谢疾病（如肥胖/糖尿病）、神经和精神疾病（如阿尔兹海默症/抑郁症）、炎症…
- 发育和分化：早期胚胎发育、个体/组织/器官生长发育、干细胞分化与命运决定、衰老
- 环境暴露与响应：污染、抗逆、生活方式
关于m6A甲基化研究思路
（1）整体把握m6A甲基化图谱特征：m6A peak数量变化、m6A修饰基因数量变化、单个基因m6A peak数量分析、m6A peak在基因元件上的分布、m6A peak的motif分析、m6A peak修饰基因的功能分析
（2）筛选具体差异m6A peak和基因：差异m6A peak鉴定、非时序数据的分析策略、时序数据的分析策略、差异m6A修饰基因的功能分析、差异m6A修饰基因的PPI分析、候选基因的m6A修饰可视化展示
（3）m6A甲基化组学&转录组学关联分析：Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、m6A修饰目标基因的筛选策略
（4）进一步验证或后期试验
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参考文献：
Xu M, Zhuo R, Tao S, Liang Y, Liu C, Liu Q, Wang T, Zhong X. M6A RNA Methylation Mediates NOD1/NF-kB Signaling Activation in the Liver of Piglets Challenged with Lipopolysaccharide. Antioxidants (Basel). 2022 Sep 30;11(10)
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