非因解读 | 单细胞空间蛋白质组学分析揭示临床显著性前列腺癌多参数相关MRI检查的异质性

单细胞空间蛋白组分析是一项基于荧光标记抗体染色的超多标组织成像技术，该技术将多重蛋白表达谱的定性、定量信息与单细胞组织原位信息进行整合，可在一张病理切片上基于组织及细胞原位对多达60 种蛋白进行多种分析。

非因生物建立的单细胞空间蛋白组分析平台为临床病理组织的空间细胞生物学和蛋白功能深度分析提供了全新的分析手段，平台拥有350+ 经严格验证的抗体资源库，支持结合研究方向和研究热点设计灵活的整体实验方案，是肿瘤微环境、免疫学肿瘤生物学、神经生物学、病理标志物诊断的全新研究利器。

下面，我们通过一篇分析研究案例，来展示单细胞空间蛋白组学分析的应用场景和应用价值，以及结合其他组学技术进行肿瘤微环境研究和新型诊疗标志物发现的研究模式。

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研究背景

由于前列腺癌筛查诊断准确性差而受到相当大的争议（1），前列腺多参数MRI（mpMRI）的使用迅速增加。由于技术的改进，可以使用mpMRI透视离散的前列腺内病变（2-5）。这些前列腺医学磁共振成像图像的解释和对前列腺癌的怀疑程度已随着前列腺成像报告和数据系统的发展而变得标准化（PI-RADS;参考文献6）。然而，mpMRI检查的假阳性（例如，PI-RADS分类4-5伴良性活检）和假阴性[例如，PI-RADS分类1-2伴有临床意义的前列腺癌（csPCa）]前列腺案例并不少见（7，8）。尽管存在许多准确的前列腺mpMRI解释的混杂因素（9），并且一些假阳性和假阴性的mpMRI结果可能归因于放射科医生解释的变异性（10，11），但一些前列腺癌肿瘤被认为是在mpMRI上固有的检测不到的（例如，“mpMRI不可见”）。mpMRI可见性与肿瘤学结果之间的潜在联系最近才被探索（12-15），并且由于mpMRI的相对现代使用，中长期肿瘤学结果非常有限。尽管之前已经报道了mpMRI可见性的分子特征（12，16，17），但将mpMRI可见性与临床结果联系起来的潜在分子和细胞机制尚未确定。

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研究目的

为了更好地表征前列腺癌的mpMRI可见性，本研究使用单细胞空间蛋白分析（超多标多重免疫荧光，MxIF）和基因表达谱分析对接受根治性前列腺切除术的mpMRI可见和mpMRI不可见前列腺癌的临床匹配患者的组织进行分子和微量检查，以寻找mpMRI不可见的前列腺癌与mpMRI可见肿瘤以及正常的前列腺组织之间的肿瘤结构差异。

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实验设计

研究者利用接受根治性前列腺切除术的临床匹配的mpMRI不可见和mpMRI可见csPCa患者的肿瘤组织，进行多重免疫荧光单细胞空间成像和基因表达谱分析，并专门开发了基于人工智能的分析算法来分析和表征肿瘤生态系统，并与相应的转录组学数据进行集成分析。

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研究结果及研究结论

1. 与mpMRI可见前列腺癌肿瘤相比，mpMRI可见前列腺癌肿瘤表现出更复杂的上皮肿瘤结构

揭示从具有临床意义的前列腺癌（Gleason Score ≥7）的匹配患者（临床和病理学上）收集的mpMRI不可见和mpMRI可见前列腺癌肿瘤之间的肿瘤结构差异，其中单个病变接受了根治性前列腺切除术（图1A和B），我们采用基于AI的MxIF分割平台来分析整个处理过的组织载玻片（n = 14，每组7名患者），大约70个感兴趣区域（ROI）/载玻片，证明了该分析流程能够可靠地处理和检查整个肿瘤组织（图2A）。MxIF分析包括14种不同的标志物，包括上皮细胞标志物PCK26和NaKATP酶，内皮细胞标志物CD31，常用的T细胞标志物CD4和CD8，FOXP3识别Tregs和巨噬细胞标志物CD68。这种基于AI的分割分析方法能够对前列腺癌肿瘤进行全面和自动化的评估，包括单细胞分辨率的可视化，分割，细胞分型，肿瘤结构和空间相互作用的建模，以及软件生成的不同分割区域的使用（图2B）。在利用这些标记物和这种基于AI的分割分析方法的基础上，研究了单细胞空间结构，以揭示可能使mpMRI不可见前列腺癌肿瘤的分子，细胞和结构机制。总体分析包括恶性细胞密度的计算，恶性细胞邻居的数量，恶性和非恶性区间室之间的基质分布差异（例如，Wasserstein距离），免疫细胞组成以及与患者复发的相关性。

如图2C-E所示，对每个mpMRI不可见和mpMRI可见前列腺癌肿瘤（每个n = 7）进行自动细胞分型。病理学家对每个肿瘤ROI的审查导致每个ROI都注释为“腺体”或“紧凑而复杂”。每个肿瘤包括8至50个（平均值=23）个肿瘤ROI，所得两类肿瘤结构的含量(如图2F所示)。mpMRI可见前列腺癌肿瘤具有较高含量的肿瘤ROI，被归类为复杂的肿瘤结构，其特征在于基质和腺体成分之间缺乏明确的边界。相比之下，mpMRI不可见的前列腺癌肿瘤的特征在于肿瘤ROI具有圆形的腺体结构，表示为相对清晰且大部分均匀的轮廓和散布有基质的间隔较小的腺体（图2F）。7名患有mpMRI不可见肿瘤的患者中有2名患者具有紧凑而复杂的肿瘤结构的小面积（<30%的肿瘤ROI），而患有mpMRI可见肿瘤的7名患者中有5名患者在其肿瘤中具有紧凑和复杂的肿瘤结构的大面积（40%-100%的肿瘤ROI;图 2F）。该分析表明，使用MxIF与生物信息学管道相结合的综合成像应用能够准确测量恶性细胞密度和细胞-细胞接触。接下来，检查恶性细胞密度和空间邻近性（图3A），以确定这些参数是否可以解释mpMRI的不可见性。恶性细胞密度的计算方法是恶性细胞的总数除以肿瘤区域面积。mpMRI可见前列腺癌肿瘤增加了邻近的恶性细胞，量化为80μm半径内靠近一个恶性细胞的恶性细胞的数量（图3B; P = 0.06）和更高的恶性细胞密度（图3B;P = 0.1）。邻近恶性细胞的数量与肿瘤细胞密度密切相关（图3C; Spearman rs = 0.87， 两个图的P值< 0.001）。前列腺癌肿瘤结构的密度和复杂性可能是通过mpMRI检测它们的基础。此外，与mpMRI可见的前列腺癌患者相比，mpMRI可见前列腺癌患者的生化疾病复发率更高（71% vs. 0%，P = 0.03），平均随访近5年。较高的恶性细胞密度和邻近的恶性细胞，两个mpMRI可见性特征，与患者复发有关（图3C），表明成像可见性，特别是PI-RADS 5可见性，可能与前列腺癌临床结果不佳有关。

评估每个肿瘤的恶性和非恶性（正常）区室中的基质结构，因为已知恶性基质会影响前列腺癌的侵袭性（图3D，代表性图像），证明前列腺癌微环境对肿瘤表型的影响。总体而言，62%的mpMRI可见前列腺癌肿瘤（n = 7）显示出更紧凑和复杂的肿瘤结构，以肿瘤形成不良的腺体结构为代表，而没有干预基质。然而，恶性和非恶性区室中的基质区域在mpMRI不可见和mpMRI可见前列腺癌之间没有显着差异，这表明两组之间的基质组织相似（图3E）。

图1 mpMRI检查可视和不可视前列腺癌患者代表性图像及患者的临床特征参数

图2 基于人工智能的区域分割分析流程显示，mpMRI可见的前列腺癌肿瘤具有紧凑而复杂的肿瘤结构

图3 mpMRI可见和不可见的前列腺癌患者基质组织结构分析

2. mpMRI不可见和mpMRI可见前列腺癌肿瘤恶性区域中上皮细胞免疫浸润程度低

通过mpMRI不可见和mpMRI可见前列腺癌肿瘤的免疫组成进行分析，以确定免疫微环境和炎症状态的差别。具体而言，使用MxIF标记物，确定mpMRI不可见和mpMRI可见前列腺癌肿瘤内的细胞类型及其位置（图4A和B）。使用前列腺癌肿瘤的t-SNE图可视化细胞群，并通过MxIF成像确认（图4B和C）。MxIF可视化能够识别非恶性和恶性区域（包括上皮）中前列腺癌肿瘤的细胞组成，具有代表性的肿瘤图像和各个亚区室的放大率（图5A）。为了对具有不同大小的恶性和非恶性（正常）区域、及具有不同细胞数/面积的每个样品进行数据处理，细胞计数按区域面积进行归一化以比较细胞密度。细胞分型显示正常上皮细胞与恶性上皮相比，免疫细胞，特别是CD8+T细胞密度更高（图5B）。值得注意的是，所有前列腺癌肿瘤的恶性上皮细胞都缺乏免疫细胞（图5B），这可能是前列腺癌中免疫检查点阻断的适度成功的基础（18）。还已知前列腺癌具有低肿瘤突变负荷，直接降低新抗原表达（19），使前列腺癌肿瘤变得寒冷且难以穿透免疫疗法。此外，在mpMRI可见性前列腺癌肿瘤恶性基质中的CD4+T细胞含量较高（图5C），并且基质细胞(即潜在的成纤维细胞，包括癌症相关成纤维细胞)在mpMRI不可见前列腺癌肿瘤的恶性上皮和基质中含量更高（图5B）。免疫浸润与mpMRI可见度或前列腺癌复发无关，这表明其他分子和细胞特征，如基质组织，较高的WD值和恶性细胞的数量是mpMRI可见度的更好指标。然而，在复发的前列腺癌与非复发的肿瘤相比，观察到巨噬细胞水平略微升高和基质细胞（即潜在的成纤维细胞和CAFs）水平略低（图5D）。

图4 MxIF分析可以对每个前列腺癌肿瘤组织进行细胞分型

图5 mpMRI可见和不可见的前列腺癌患者组织没有发现明显的免疫细胞组成差异

3. mpMRI可见前列腺癌肿瘤中基质富集相关基因表达减少

研究者还使用HTG EdgeSeq肿瘤学生物标志物组对mpMRI不可见和mpMRI可见的前列腺癌肿瘤进行基因表达分析，24个基因被确定为mpMRI不可见组和mpMRI可见组之间差异表达最多的基因（DEG），表达差异变化为≥2或≤−2，P <0.05，FDR（q值）≤0.5（图6A）。在这些DEG中，丝状蛋白C（FLNC）（FDR<0.1）是差异表达最显著的基因，在mpMRI可见的前列腺癌肿瘤中具有显着的下调（图6A-C）。FLNC编码肌动蛋白结合蛋白，是细胞骨架的重要组成部分，在前列腺癌的细胞迁移中起作用（20）。FLNC表达的变化与各种癌症的临床结果有关，如前列腺癌，胃癌，肝细胞癌和多形性胶质母细胞瘤（21-23）。mpMRI不可见肿瘤显示出FLNC（FDR = 0.018）和其他细胞粘附相关基因的显着更高表达，包括整合素编码基因ITGA9（FDR = 0.19）和ITGA7（FDR = 0.2）以及DES (desmin)（FDR = 0.2; 图 6A）。此外，DNAJB5（FDR = 0.03）在mpMRI可见的前列腺癌肿瘤中的表达显着降低（图6A和B）。DNAJB5属于大而多样的热震蛋白（HSP）家族，其成员充当肿瘤启动子或抑制因子（24）。接下来，我们确认了所选基因是否在生物学相关途径中显着富集。细胞粘附途径，包括局灶性粘附和整合素相关途径，是mpMRI不可见组中最富集的途径之一（表1）

图6 与mpMRI可见的前列腺癌组织相比，mpMRI不可见的前列腺癌肿瘤具有更高的间质相关基因表达

表1 mpMRI可见和不可见的前列腺癌组织之间DEGs通路富集分析

4. mpMRI不可见的前列腺癌肿瘤在分子、细胞和结构水平上类似于正常的前列腺组织

研究者利用包含正常前列腺（n = 52）和前列腺癌（n = 504）组织的TCGA数据集，在更大队列中对上述发现进行分析和评估，计算24个基质基因表达的标志性评分（图6A），将前列腺癌组织样本按中值分为“高”和“低”基质特征组（图6D）。比较了正常前列腺和前列腺癌组织的表达谱，正常前列腺组织在我们的队列中显示出高基质基因表达特征，这也被较高的FLNC表达所证明（图6E），这表明mpMRI不可见的前列腺癌组织在基因表达和分子水平上更接近正常前列腺组织。

FLNC和其他细胞粘附相关基因的富集表达支持了空间成像结果，其中mpMRI不可见前列腺癌组织的基质组织类似于正常前列腺组织。此外，与低基质基因表达特征前列腺癌组织相比，高基质基因表达组织在分子上与mpMRI不可见的前列腺癌组织相似，在肿瘤区域具有更高的CAF基因特征评分（P <0.001）。CAFs在前列腺癌中起着复杂的作用，虽然大多数数据表明它们在促进肿瘤发生方面起作用，但它们已被证明在某些环境中抑制肿瘤生长（25-27）。为了进一步证实我们的发现，我们评估了两个随机选择的高基质基因表达特征性前列腺癌组织与来自TCGA的两个随机选择的低基质基因表达特征前列腺癌组织（图6F）。高基质基因表达组织纤维化面积较大，纤维结缔组织分布均匀，肿瘤细胞大多具有单层上皮组织（图6F）。重要的是，FLNC先前被确定为与两个人类前列腺癌队列中无生化复发（BCR）无生存期显着相关的七个基因之一（总共n = 188），FLNC的较高表达与显着改善的无BCR生存率相关（28）。表达高基质特征的前列腺癌肿瘤[即，表达类似于mpMRI不可见前列腺癌组织的24个基因的表达（图6A）]，与低特征样本相比，具有更好的无进展生存期（PFS）和无BCR生存率（P = 0.002和P = 0.2;图 6G）。与FLNC表达较低的前列腺癌肿瘤相比，具有较高FLNC表达的前列腺癌肿瘤具有更好的PFS，这表明MPMRI不可见的前列腺癌（P = 0.02）。事实上，较高的FLNC表达与前列腺癌中更好的无复发生存率有关（28，29），进一步支持了mpMRI不可见前列腺癌与mpMRI可见前列腺癌相比具有更好的临床结果的观点。最后，研究者对FLNC表达进行综合分析，结合恶性细胞密度表示的空间组织分布，基于mpMRI可见性和前列腺癌复发情况，产生了最佳的样品分离数据（图6H;14个同时具有表达谱数据和MxIF数据的样品）。

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