【实验技术笔记】细胞表型检测之细胞增殖（CCK-8法 + BrdU掺入法 + 平板克隆）

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1. 细胞增殖的定义

• 通过检测细胞数量来判断细胞是否增殖：CCK-8 法，MTT 法。
  推荐 CCK-8 法，灵敏度高，重复性好，数据可靠，操作简便，省时省力。水溶性，不需要换液，尤其适合悬浮细胞，不需要加放射性同位素或有机溶剂，基本无细胞毒性，不伤害细胞，检测完后的细胞可重复利用。开盖即用，不需要配制。
• 通过检测细胞分裂时的物质变化来判断细胞是否增殖：BrdU 掺入法

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2. 检测细胞数量：CCK-8 法

(1) Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 分析细胞增殖的原理：

试剂盒中的水溶性四唑盐 WST-8 是 CCK-8 的主要成分，粉色，可以直接加入细胞中，在电子载体 1-Methoxy PMS 的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜类染料（Formazan），并释放到细胞外溶解在培养基中，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在 450nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

• 适用于检测贴壁细胞和悬浮细胞数量
• 不能检测组织中的细胞数量
• 不能确认细胞数量的变化是由细胞增殖增多还是细胞凋亡减少引起的，需要配合其他实验结果进行综合判断

(2) CCK-8 测细胞增殖操作流程

★ 预实验：做几个孔，摸索接种细胞的数量 和 加入 CCK-8 试剂后的培养时间。

• 接种细胞数量：CCK-8 至少要测 5 天，因此接种的细胞量要保证长到第五天时，细胞不能长得太满。
• 培养时间：根据细胞种类不同、每孔细胞数量多少来定。如，白细胞难显色，因此要培养时间较长或要增加细胞数量；悬浮细胞相对于贴壁细胞更难显色，加入 CCK-8 1-4h 后用肉眼看下显色程度，或用酶标仪检测，如果显色困难，就将培养板再放回培养箱继续培养数小时；贴壁细胞培养 30min 就可以取出来看显色程度。CCK-8 最佳反应时间是以具体显色的最佳时间为准。

★ 正式实验：
① 制备细胞悬液铺 96 孔板。

• 贴壁细胞要消化充分（可以稍过一点点），这样不需要用力吹打就可以让细胞分散得很好；如果消化不完全，就要用枪用力吹打，使细胞受到机械损伤，影响实验结果。
• 消化后要做细胞计数，调整到合适的密度（预实验摸索到的细胞接种量）。
• 铺 96 孔板：
  △ 要铺均匀，先在每孔中加 50ul 完全培养基（可以在孔中形成液体的表面张力，使后面接种的细胞分散开），再向各孔加 50ul 细胞悬液。这里相当于把细胞稀释了 1 倍，因此前面调整细胞密度时要把细胞密度加倍。
  △ 铺板时注意不时地混匀细胞悬液，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下，保持细胞悬液随时都是均匀状态，尽量保证加到每个孔中的细胞数量都是一致的。
  △ 96 孔板周围一圈孔不加细胞，而是加满 PBS，因为周围孔在培养箱中持续培养的过程中容易蒸发，不适合铺细胞，加 PBS 可以保护被围在中间的孔。
  △ 铺完板后，轻敲板底或用振荡器摇板，帮助细胞分散。

② 37℃培养箱中培养。 转移 96 孔板时，注意尽量端平端稳，一般状态好的细胞 2h 就能贴壁。

③ 加 CCK-8 试剂 10μl/well。细胞贴壁后，加 CCK-8 采集 0 点的数据。

• 使用新鲜的完全培养基稀释 CCK-8（CCK-8: 培养基=1:10），完全混匀，把带测控中旧的培养基吸出，每孔加入 100-110ul 新配好的含 CCK-8 的培养基（保证每孔加样量一致即可，这样做可以避免直接加 10ul CCK-8 引起的加样误差）。
• 加液时，注意沿着孔壁慢慢加，尽量避免出现气泡（影响酶标仪读数），如果有气泡也不用着急，可能再培养之后气泡就消失了。
• 配 CCK-8 时，多配 1-2 份（看做了多少板）含 CCK-8 的培养基，加入同一块板的空孔作为调零孔（如果细胞培养时含药物，调零孔也要加药物，只是不加细胞）；如果一次测多块板，每块板都要加调零孔。

④ 继续培养数小时（具体时间是预实验摸索好的）。肉眼看到培养基变成橙色，培养时间越长，橙色越深。

⑤ 测定 450nm 处 OD 值。

• 培养到合适时间，上酶标仪检测 OD 值，OD 值控制在 0.2-1，1 左右较好。
• 建议用双波长检测，检测波长 450nm、参比波长 600-650nm 两个波长各检测一遍，参比波长可以过滤掉因为液体浑浊、孔板底不干净带来的测量误差。
• 建议检测时间定点。每天在同一个时间点检测，这样每两次检测时间间隔相同，有助于得到更准确的数据。
  

(3) CCK-8 测细胞增殖实验分组设计

• 周围一圈加满无菌 PBS，中间粉色区域铺细胞
• 分三组，每组至少 3 个复孔：
  ◆ 空白对照：不做任何处理的细胞
  ◆ 阴性对照：如，转染了对照质粒的细胞
  ◆ 实验组：如，转染了过表达质粒的细胞
• 中间最后一列留作调零孔，从上到下刚好 6 个孔，测 5 天，每天一个孔。
• 酶标仪测 OD 值时，要取下 96 孔板的盖子，迅速测完，细胞不会污染。
• 也可以提前规划好，把同一个时间点的细胞铺在同一块板上，测一块丢一块。

(4) CCK-8 数据处理与绘图

例如：检测波长 450nm，参比波长 600nm。

• 第一步：x = OD450nm－OD600nm。（计算每孔的△OD，调零孔也要计算）
• 第二步：y = x – △OD_调零孔。每孔的△OD 减去调零孔的△OD，如果所用的仪器可以自动调零，跳过这一步计算。
• 第三步：复孔求平均值。
• 第四步：将独立重复 3 次的数据导入 graphpad prizm 画折线图。
• 如果需要测定细胞的具体数量（想知道细胞每天涨了多少个），需要建一个标准曲线。
  细胞计数 → 等比稀释细胞，建立 5-8 个梯度，3 复孔/梯度 → 37℃培养箱中培养 → 加 CCK-8 试剂继续培养细胞 → 测定 OD 值 → 制作标曲，x 轴为细胞数量，y 轴为 OD 值。

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3. 检测细胞增殖：BrdU 掺入法

细胞周期

• 细胞周期分为间期和分裂期，间期包括 G1 期、S 期、G2 期。
  △ G1 期：DNA 合成前期，合成 RNA 和蛋白质，为 DNA 复制做准备；
  △ S 期：DNA 合成期，DNA 复制，合成组蛋白与 DNA 形成染色质，合成 DNA 复制所需的酶；
  △ G2 期：DNA 合成后期，DNA 合成终止，合成 RNA 和蛋白质，为有丝分裂做准备。
  △ M 期：细胞分裂期。
  
• 通过检测细胞间期的物质变化来判断细胞是否处于细胞周期中，从而判断细胞是否在增殖。
• 检测 DNA 的合成：BrdU 掺入法
• 检测 MCM2 表达：微小染色体维持蛋白 2（MCM2），属于 MCM 家族成员，是真核细胞 DNA 复制的主要调控因子，在 G1-S 转换点达到峰值，在分化期和静息期表达缺失。用 IHC 或 IF（免疫荧光）检测，表达 MCM2 的细胞表明该细胞在增殖。
• 检测 PCNA 表达：Proliferating Cell Nuclear Antigen 增殖细胞核抗原，是 DNA 聚合酶的辅助蛋白。在细胞核内存在可溶性与不溶性两种 PCNA，可溶性 PCNA 在细胞周期各期中均有表达，其量在 DNA 合成过程中不发生明显变化，易被去污剂提取、甲醇破坏；不溶性 PCNA 较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种 PCNA 在 G0～G1 期细胞中无明显表达，G1 晚期，其表达大幅度增加，S 期达到高峰，G2～M 期明显下降，其量的变化与 DNA 合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标。
• 检测 Ki67 表达：核抗原，是细胞核内分裂增殖相关蛋白，在细胞周期 S、G1、G2、M 期均有表达，G0 期缺如。常作为肿瘤细胞增殖活性的可靠标记，肿瘤生长越快，组织分化能力越差，而对 ki67 越敏感。一般来说这样的肿瘤，预后都是较差的，晚期的肿瘤由于其分裂较快而细胞的分化较不完善，从而造成 ki67 的敏感性增高。

BrdU 掺入法分析细胞增殖的原理

• BrdU 溴脱氧尿嘧啶核苷，是胸腺嘧啶 T 的类似物，给正在合成 DNA 的细胞掺入 BrdU，BrdU 就会与 T 竞争性插入新合成的 DNA 链中，新合成的 DNA 链随机分配到子代细胞中，通过 BrdU 抗体就可以检测掺入到细胞中的 BrdU，就能知道哪些细胞是增殖旺盛的细胞。
  

BrdU 掺入法测细胞增殖操作流程

（1）样本准备：

• 对于贴壁细胞：把细胞铺到玻片上，用 BrdU 与细胞孵育 1h（原代细胞增殖缓慢，需要孵育 24h 以上），去掉培养上清，用 4% PFA 固定。
• 对于动物：按 10ul/g 体重腹腔注射 BrdU（20g/L in PBS），2h 后处死动物取组织，4% PFA 4℃固定过夜，石蜡包埋切片，脱蜡至水。

（2）DNA 变性：柠檬酸修复液煮 30min 后立即放入冰水冷却 5-10min。（DNA 链打开，让 BrdU 掺入 DNA）
（3）5% BSA 封闭，Mouse anti-BrdU 一抗室温孵育 30min（根据抗体确定具体孵育时间），PBS 5min × 洗 4 次，FITC-anti-mouse 二抗室温孵育 1h。
（4）DAPI 复染，封片、拍照。

• 试剂推荐：
  BrdU, sigma (B5002)；
  Anti-brdu, millipor 05-633 (1:50)

BrdU 掺入实验分组设计

数据处理与绘图

（1）拍照

• 拍照时，每张片子随机拍摄 3 个视野，放大倍数以方便细胞计数为宜，比如 40 ×。
• DAPI 染色（染细胞核，代表总细胞数）和 BrdU 染色（染正在增殖的细胞）的照片都要拍，同时注意保存 DAPI 和 BrdU merge 的照片。

（2）数据处理

• 第一步：计数 DAPI 阳性的细胞数；
• 第二步：计数 BrdU 阳性的细胞数；
• 第三步：将同视野下 BrdU 阳性细胞数 / DAPI 阳性细胞数 × 100%，得到 BrdU 阳性细胞数的占比；
• 第四步：将同张片子上 3 个视野的 BrdU 阳性细胞数百分比求平均值， 依次将所有片子分析完；
• 第五步：将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。

● 细胞计数的方法：
【ImageJ 图像处理】6. 自动细胞计数

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4. 检测细胞增殖：平板克隆

• 有些细胞在增殖过程中可以形成克隆。
• 在克隆内，细胞和细胞之间的连接比较紧密，一个细胞就能形成一个大的克隆。

平板克隆的原理

• 平板克隆：把细胞消化成单细胞悬液，按合适的密度铺到培养皿中，贴壁细胞会在培养皿中贴壁，不是每个贴壁细胞都能增殖和形成克隆，但能形成克隆的细胞一定是有增殖活力的，所以可以根据细胞的克隆形成率来判断细胞的增殖能力，此外，克隆形成率还能反应细胞的群体依赖性。
• 不同的细胞克隆形成能力不同：原代培养的细胞克隆形成能力弱，可传代的细胞系强；二倍体细胞克隆形成能力弱，转化细胞系强；正常细胞弱，肿瘤细胞强。
• 适用于检测贴壁细胞，不适用于检测悬浮细胞、组织样本。

平板克隆检测细胞增殖的操作流程

1. 细胞计数：取对数生长期的单层培养细胞，用 0.25%胰酶消化并吹打成个单细胞悬液，把细胞悬液悬浮在 10%胎牛血清 (FBS) 培养基中，取 0.3ml 单细胞悬液，加 0.9ml 0.5%-1%的台盼蓝染液混匀后计数 活细胞。用细胞计数板人工计数或用自动细胞计数仪计数。
   ◆ 活细胞：计数计的是活细胞的数目。要看细胞贴壁后增殖形成克隆的能力，死细胞不能贴壁，且每个皿中铺的细胞数特别少，如果混入死细胞，会带来较大的误差。
   ◆ 0.5%-1% 的台盼蓝染液使死细胞染成蓝色，活细胞不能着色。还可以用 0.02% 的藻红 B 染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用 0.05% 的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。

2. 铺细胞：将单细胞悬液做梯度稀释，以适当的细胞密度（根据增殖能力）接种于培养皿中。一般分每皿 50、100、200 个细胞的梯度密度分别接种含 37℃ 预温的含 10%FBS 的培养液的皿中，使细胞分散均匀。可以画十字将细胞晃匀。

3. 培养：铺好细胞的皿置 37℃ 5% CO₂ 及饱和湿度的环境下，静置培养 2-3 周，随时观察克隆形成状况。中间需要换液（换液可以用半量换液法：轻轻吸去一半的旧培液，不干扰底层培养液，用枪沿着皿内壁缓缓加入新培液）时要尽量轻柔，避免微小克隆里的细胞脱落迁移到别处形成新的克隆，干扰最终的结果。注意经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。

4. 固定：弃去培养上清液，用 PBS 小心浸洗 2 次。加纯甲醇或 1:3 醋酸/甲醇 5mL，固定 15min。

5. 染色：去除固定液，加适量 Giemsa 染色液染 10-30min 把克隆染成紫色（也可以用考马斯亮蓝染成蓝色），用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。

6. 拍照、计数。

• 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁细胞。
• 适宜底物为玻璃、塑料瓶皿。
• 实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。

克隆形成实验分组设计

数据处理与绘图

• 拍照时，使用（带白光模式，底部带补光板的）成像仪或相机拍摄整个皿。
• 将平皿倒置，用带网格的透明胶片叠在培养皿上（或者用记号笔在培养皿盖上画网格，盖子翻过来，把皿叠在盖子上，主要是防止漏计数），肉眼计数（先用低倍镜观察大于 50 个细胞的克隆用肉眼看大致有多大，再用肉眼计数），或在低倍镜下计数大于 50 个细胞的克隆数，或者拍照后用软件计数。
• 计算公式：克隆形成率= $\frac{克隆数}{接种细胞数}$ ×100%
• 将 3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。

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