ATAC-seq数据分析流程

0. ATAC-seq原理

0.1 染色体结构

0.2 原理

ATAC-seq通过Tn5转座酶来富集开放染色质区域的DNA序列，经PCR扩增后进行NGS测序。

0.3 结果

1. ATAC的插入片段揭示了核小体的位置
2. ATAC文库中，位于两个相邻核小体之间的序列，称之为nucleosome-free fragments, 简称NRF。这部分序列的peak可以用来表征TSS的位置
3. ATAC在全基因组范围内捕获开放染色质区域的序列，可以识别细胞内正发挥调控功能的转录因子。

0.4 意义

1. ATAC-seq数据分析流程

1.1 上游分析

（1）序列质控和比对

1. fastqc
2. trim_golare
3. bowtie2

   mapping时要加上参数 --very-sensitive -X 2000
   

（2）序列筛选

1. 去除线粒体基因和叶绿体基因

   因为这些基因上没有组蛋白结合，不在研究范围内，而其存在会影响整体的分布
   

2. 去除Encode上规定的blacklist区域

   这些区域是已公布的信号异常区域，需要去除
   

3. 去重
   ?? reads去重梳理

   1. 去除PCR重复和光学重复
   2. 步骤
   	1. 标记重复的reads
   	    - MarkDuplicates
   	2. 去除重复的reads
   	    - bedtools 
   	    - samtools 	
   

4. 去除X、Y染色体区域

   不研究性别的可以去除
   

（3）Shifting reads

0. 原理

   Tn5酶是以二聚体的形式结合到染色体上的，其跨度为9bp，需要回补这9bp的碱基差
   

1. 步骤

   - 正义链——正向移动4bp
     反义链——反向移动5bp
   - alignmentSieve软件
   - tips：不做reads shift对单碱基分辨率高的分析有影响，如TF motif footprinting
   

（4）Peaking calling

0. 原理

   Tn5在染色体上的结合为一个概率性的事件，需要利用统计检测来判断一个位置的reads是否足够成为一个peak
   

1. 步骤

   - 软件：macs 
   -  设置peak标准
   	- p-value
   	- 建模方式
   	- -nomodel --shift -75 --extsize 150 
   

（5）峰文件bw的生成

（6）组间标准化

1. 单个样本自身ATAC信号标准化

   在并不是bam to bw 时，单个样本将自身ATAC信号进行RPKM标准化
   

2. 多个样本时，组间标准化

   - haystack中的haystack_hotspots
   	- 输入bw文件
   

（7）上游处理后文件：bed、bw

1. Bed文件

   - 作用：
   	- call peak 过后的峰位置文件
   	- 定义特定的峰区域
   - 每行信息：
   	- chrom、chromStart、chromEnd 	
   	- 添加额外9列
   -  macs 进行call peak后的peak文件
   	- narrowPeak：就是峰的bed格式文件
   	- summit_bed: 峰的中心点
   - ？？bed文件格式 	
   

2. bw文件

   - 作用：
   	- 方便可视化peak
   		- 因为上游处理完的bam文件通常比较大，不方便快速展示，一般会将其转化为bw(bigwig)
   		  或者wig文件，其中bigwig文件的显示性能较wig文件快，故bw更常用
   	  - 相较于bed文件，bw文件不只提供了peak的位置，还有peak的高低 	
   

1.2 数据质控

指标

1. 比对率

   通常要求在95%以上，但80%也是可以接受的
   

2. 插入片段长度统计

   - 插入片段长度是评估实验好坏的指标
   - 统计出的插入片段长度应该符合实验预期的长度
   

3. FRiP(Fraction of reads in peaks)

   - peaks中的reads与总reads的比例。
   	- 即文库中结合位点片段占背景reads的比例，可理解为'信噪比'
   	- 也是样本富集效果的评价指标，可在一定程度上反应富集效果
   	- 通常要求大于0.3，大于0.2也可以接受 	
   

4. 库的复杂度

   - 与reads结合的独特性有关
   - 参数
   	- NRF > 0.9
   	- PBC1 > 0.9
   	- PBC2 > 3 	
   

5. 重复性鉴定
   1. bam文件的重复性

      deeptools 的 plotCorrelation
      

   2. peak的重复性

      IDR
      

1.3 下游分析

下游分析就是围绕bed和bw文件展开的

（1）TSS等位点的peak plot展示

1. 想看的peak区域（bed文件）+ 特定样本（bw文件）

   deeptools包中的两个命令
   	  1. 构建矩阵：```computeMatrix```
   	  2. 展示：```plotHeatmap/plotProfile```
   

（2）Motif 分析

1. 软件：homer中的findMotifsGenome.pl

   tips: 在输入前需将narrowPeak转变为特定格式的tmp文件再读入
   

（3）Peak对应的基因注释

1. 将bed文件输入Great网站

    tips：
    1）bed文件需要加一列名字列，给每个peak一个名字
    2）注意关注的peak对应的基因范围，看远端peak的话，TSS上游5kb，下游1kb
   

（4）Peak对应的区域注释

1. 软件：homer中的annotatePeaks.pl
2. 输入目的区域的bed文件

（5）对Peak的操作

1. 选取特定区域：bedtools——对peak取交集、并集等

1.4 进阶分析

（1）peak分类

1. 按照两组样本之间的差异peak分类

   - bam to count思路
   	- bedtools multicov + DESeq2 
   

2. 将peak进行promoter及enhancer分类

（2）PCA

主成分分析主要看样本分布的情况

1. deeptools里面的plotPCA
2. 将bam转换成count，再用DESeq2做

（3）选定特定基因对应的区域画图

1. 先将基因分好类
	- 组别在三者及以上时 ，采用差异基因的两两组合或者差异peak的两两组合，来实现peak的独特分类方式
2. 再找基因对应的peak区（Great来进行反向查看）
3. 画出对应peak的热图，以观察其有无ATAC信号不同的分布特点

Reference：

1. ATAC-seq汇总