RPKM、FPKM和TPM的区别

前言

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在RNA-Seq的分析中，我们常用RPKM、FPKM和TPM作为转录组数据定量的表示方法。它们都是对表达量进行标准化的方法，为何不直接用read数表示，而选标准化呢，因为落在一个基因区域内的read数目取决于基因长度和测序深度。基因越长read数目越多，测序深度越高，则一个基因对应的read数目也相对越多。所以必须要标准化，而标准化的对象就是基因长度与测序深度。

RPKM

Reads Per Kilobase of exon modelper Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的reads)，主要用来对单端测序（single-end RNA-seq）进行定量的方法。

RPKM(推荐软件，Range) 的计算公式：

RPKM= total exon reads/ (mapped reads (Millions) * exon length(KB))；

total exon reads：某个样本mapping到特定基因的外显子上的所有的reads；

mapped reads (Millions) :某个样本的所有reads总和；

exon length(KB)：某个基因的长度（外显子的长度的总和，以KB为单位）。

你可以用这个公式计算基因，外显子，转录本的表达，这里以基因的表达为例进行说明。在一个样本中一个基因的RPKM等于落在这个基因上的总的read数(total exon reads)与这个样本的总read数(mapped reads (Millions))和基因长度(exon length(KB)) 的乘积的比值。

FPKM

Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments(每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments)，主要是针对pair-end测序表达量进行计算。

FPKM (推荐软件，cufflinks) 和RPKM 的计算方法基本一致。

FPKM和RPKM的区别就是一个是fragment，一个是read。对于单末端测序数据，由于Cufflinks计算的时候是将一个read当做一个fragment来算的，故而FPKM等同于RPKM。 对于双末端测序而言，如果一对paired-read都比对上了，那么这一对paired-read称之为一个fragment，而如果一对paired-Read中只有一个比对上了，另外一个没有比对上，那么就将这个比对上的read称之为一个fragment.而计算RPKM时，如果一对paired-read都比对上了会当成两个read计算，而如果一对paired-read中只有一个比对上了，另外一个没有比对上，那么就计read数为1。 故而即使是理论上将各个参数都设置成一样的，也并不能说FPKM=2RPKM。对于单末端测序，虽然理论上FPKM等同于RPKM, 但是实际上即使是使用同一个mapping软件得到的mapping结果，然后再分别去计算同一个基因的RPKM (自己人工计算，或者用现成的一些软件都能算)和FPKM(用Cufflinks计算)，结果却仍然是不同，因为Cufflinks有自己的模型和自己的一些内在算法。

TPM

Transcripts Per Kilobase of exonmodel per Million mapped reads (每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts)，优化的RPKM计算方法，可以用于同一物种不同组织的比较。

TPM (推荐软件，RSEM) 的计算公式：

TPMi=(Ni/Li)*1000000/sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)

Ni：mapping到基因i上的read数；

Li：基因i的外显子长度的总和。

在一个样本中一个基因的TPM：先对每个基因的read数用基因的长度进行校正，之后再用校正后的这个基因read数(Ni/Li)与校正后的这个样本的所有read数（sum(Ni/Li+……..+ Nm/Lm)）求商。由此可知，TPM概括了基因的长度、表达量和基因数目。TPM可以用于同一物种不同组织间的比较，因为sum值总是唯一的。(不喜欢看公式分析，那么看看这个实例吧：http://www.bio-info-trainee.com/2017.html)

总结

不管是计算FPKM、RPKM，还是计算TPM，我们都要先得到一个ReadCount的矩阵（行为基因，列为样本）。在计算FPKM和RPKM时，都是先按列（也就是这个样本的总read数）进行标化，之后再对对个基因的长度进行标准化。而TPM是先对基因长度进行标准化，之后再对列（这个时候就不再是这个样本的总read数了）进行标化。这样使得最终的TPM矩阵的每列都相同（列和都等于1），也就是说每个样本中的TPM的和都是一样的。这样就会使得我们更容易去比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。而RPKM/FPKM由于最终的表达值矩阵的列和不同，故而不能直接比较同一个基因在不同样本中所占的read数的比例。