测序有关问题

1.为什么要在上机测序之前做PCR扩增？

测到的reads数取决于flowcell上长了多少cluster（1个模板链扩增出一簇分子），有多少cluster，理论上就得到多少reads（SE测序一个cluster得到一条序列，PE测序就是一对序列）；flowcell上长多少cluster是通过文库上机浓度控制的，文库本身浓度较高，则稀释到一定浓度后再上机，以达到适中的cluster数量，一个文库如果DNA含量足够，浓度足够，可以上机多次；PCR-free文库由于不做PCR扩增，所以对样品本身的DNA含量要求比较高，这样建出的文库才能达到上机浓度和DNA量的要求。

2.上机之前做的PCR扩增与测序时做的桥式PCR有啥区别？

桥式PCR的目的是为了形成cluster，单个DNA分子反应的信号难以检测，桥式扩增后形成cluster，测序时才能捕捉到信号；

上机之前做的PCR扩增，作用见问题1；

3. 什么是接头

测序之前，要对待测的DNA片段进行包装，包装成以下格式：

正向接头(P5 + 正向引物) + 插入片段+ 反向接头(反向引物 + index/barcode + p7)

4 . 接头的作用

接头有三个作用：

一：接头的不同体现在index的不同，index的目的是为了区分样本；一台测序仪不可能就产出一个样本的数据量，多个样本一块测......

二： 在flowcell上有P5和P7两种已知序列，在接头上加P5和P7，使得read通过碱基互补固定在flowcell；

注：芯片有8条通道，在通道的内表面做了专门的化学修饰，把2种DNA序列(P5和P7)通过共价键链到玻璃表面；

三：在接头中加测序引物结合位点：测序一般要从引物下游几十个bp以后,信号才逐渐稳定,能够读出来，所以测序引物要在所测片段的上游；所以要把测序引物结合位点加到接头上；

5.什么时候加接头？

对不平整的read进行修复，5’端磷酸化，3’端加A之后加接头；

注意：有可能3’端加不上A也可以加上接头；

6. 接头与原始数据

先讲一下原始数据是怎么来的，对于一条打断的DNA片段，从5’到3’测序，分三步：

第一步：测read1；

read1引物结合位点开始测，如果打断的read小于150bp，则会测穿，测到接头；

这里需要注意的一点是read1对应两种接头，这两种接头的差别是相差一个A，因为在加接头之前，有的3’端加上了A有的没有加上A，这就导致了测穿时对应两类接头；

第二步：测index；

由read2引物结合位点开始测，测6-8个碱基，即index；

第三步：测read2；

以正向链为模板，再合成其互补链，洗掉正向链，从互补链的5’到3’测，当打断的read小于150bp，会测到接头；

我们拿到的原始数据是包含接头的，read中至多只有一端有接头 (测序由测序引物开始测，5’端肯定不包含接头，只有3’端当测穿时才可能包含接头)；

7. 接头过滤

Flexbar在过滤接头时，默认已知的接头序列与待过滤read之间最小的overlap为5bp，当overlap>=5bp时会去掉接头；

flexbar仅仅去掉一个接头，当原始数据出现接头自链(read一端有两个接头) 的情况时，不能过滤干净，也就导致了后续比对质量很差；