免疫浸润也是近几年肿瘤研究的一个重要方向。通过表达数据即可推算出这个整体样本中究竟有哪些免疫细胞。下面我们就基于数据库数据来看下整个流程分析！
前言
我们介绍了CIBERSORT，一种从其基因表达谱表征复杂组织的细胞组成的方法。当应用于计数来自新鲜、冷冻和固定组织(包括实体肿瘤)的RNA混合物中的造血亚群时，CIBERSORT在噪声、未知混合物含量和密切相关的细胞类型方面优于其他方法。CIBERSORT将使细胞生物标志物和治疗靶标的RNA混合物大规模分析成为可能。
从事免疫相关工作的研究人员，目前只需常规普通的转录组测序数据，就能拿到该样本中各类免疫细胞如DC细胞、NK细胞、CD4+ T细胞等所占比例。
例如肿瘤微环境主要由肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、各种信号分子和细胞外基质及特殊的理化特征等共同组成，肿瘤微环境显著影响着肿瘤的诊断、生存结局和临床治疗敏感性。其中免疫浸润也是近几年肿瘤研究的一个重要方向。
所以我们要清楚一个概念那就是肿瘤组织中并不是100%的细胞是肿瘤细胞，不同肿瘤组织的微环境都有着各自的特点。
那么简单肿瘤组织中存在着那么多不同类型的细胞，但是传统的转录组混池测序方法（也叫Bulk RNA-seq）是将组织整体的RNA表达水平进行检测，我们并不能有效区分究竟哪些细胞表达了哪些基因。
实例解析
1. 数据读取
在R语言中运行Cibersort共需要三个文件，分别是：
1）官方提供的22种细胞基因集"LM22.txt"；
2）基因表达矩阵；
3）Cibersort代码。
下面我们就仔细述说一下这三个文件如何来获得，如下：
1）LM22.txt获取方法：
在Cibersort论文中（https://www.nature.com/articles/nmeth.3337#MOESM207）下载Supplementry table 1，得到如下矩阵，另存为制表符分割的txt（"LM22.txt"）
2）基因表达矩阵
表达矩阵必须如下：
第一列是基因名，并且基因名必须为 SYMBOL 号模式；
第一行是样品名，不能有重复基因名；
第一列列名不能空白。
对于矩阵中表达量输入数据的要求，如下：
1.不可以有负值和缺失值
2.不要取log
3.如果是芯片数据，昂飞芯片使用RMA标准化，Illumina 的Beadchip 和Agilent的单色芯片，用limma处理。
4.如果是RNA-Seq表达量，使用FPKM和TPM都合适。
3）Cibersort代码
在R中新建R Script，复制以下网址中代码，保存为"Cibersort.R"
https://rdrr.io/github/singha53/amritr/src/R/supportFunc_cibersort.R
数据的读取我们仍然使用的是 TCGA-COAD 的数据集，表达数据的读取以及临床信息分组的获得我们上期已经提过，我们使用的是edgeR 软件包计算出来的差异表达结果，提取上调基因 2832 的 ENSEMBL 号，
###########基因列表
DEG=read.table("DEG-resdata.xls",sep="\t",check.names=F,header = T)
geneList<-DEG[DEG$sig=="Up",]$Row.names
table(DEG$sig)##
## Down Up
## 1296 2832直接用之前的转录组差异分析后的数据来演示，数据格式如下
mergedataTP<-DEG[,8:ncol(DEG)]
rownames(mergedataTP)=DEG$Row.names
mergedataTP[1:5,1:3]## TCGA-3L-AA1B-01A-11R-A37K-07 TCGA-4N-A93T-01A-11R-A37K-07
## ENSG00000142959 20 15
## ENSG00000163815 175 108
## ENSG00000107611 49 13
## ENSG00000162461 55 89
## ENSG00000163959 153 259
## TCGA-4T-AA8H-01A-11R-A41B-07
## ENSG00000142959 49
## ENSG00000163815 59
## ENSG00000107611 6
## ENSG00000162461 48
## ENSG00000163959 102Count 转 TPM
首先，提取基因长度，经过一波操作之后，得到每个基因的长度，如下：
##########提取基因长度
library(GenomicFeatures)
txdb <- makeTxDbFromGFF("F:/demo script/gencode.v22.annotation.gtf.gz",format = "gtf")
exons <- exonsBy(txdb,by="gene")
exons_length<-lapply(exons,function(x){sum(width(reduce(x)))})
exons_length<-as.data.frame(exons_length)
exons_length1<-t(exons_length)
exons_length1<-as.data.frame(exons_length1)
colnames(exons_length1)="Length"
Gene<-gsub("\\.(\\.?\\d*)","",rownames(exons_length1))
exons_length1$Gene=as.data.frame(Gene)[,1]
exons_length1[1:5,1:2]## Length Gene
## ENSG00000000003.13 4535 ENSG00000000003
## ENSG00000000005.5 1610 ENSG00000000005
## ENSG00000000419.11 1207 ENSG00000000419
## ENSG00000000457.12 6883 ENSG00000000457
## ENSG00000000460.15 5967 ENSG00000000460计算 TPM，同样经过一波操作，我们计算得到TPM的矩阵，如下：
##############计算FPKM/RPKM/TPM
le = exons_length1[match(rownames(mergedataTP),exons_length1$Gene),"Length"]
head(le)## [1] 2047 1105 13168 3195 5293 1209#这个函数是现成的。
countToTpm <- function(counts, effLen)
{
rate <- log(counts) - log(effLen)
denom <- log(sum(exp(rate)))
exp(rate - denom + log(1e6))
}
#install.packages("tibble")
library(tibble)
tpms <- apply(mergedataTP,2,countToTpm,le)
tpms[1:3,1:3]## TCGA-3L-AA1B-01A-11R-A37K-07 TCGA-4N-A93T-01A-11R-A37K-07
## ENSG00000142959 13.540046 11.98080
## ENSG00000163815 219.474345 159.79893
## ENSG00000107611 5.156847 1.61412
## TCGA-4T-AA8H-01A-11R-A41B-07
## ENSG00000142959 61.137762
## ENSG00000163815 136.370688
## ENSG00000107611 1.163758exp2 = as.data.frame(tpms)
exp2 = rownames_to_column(exp2)
exp2[1:5,1:3]## rowname TCGA-3L-AA1B-01A-11R-A37K-07
## 1 ENSG00000142959 13.540046
## 2 ENSG00000163815 219.474345
## 3 ENSG00000107611 5.156847
## 4 ENSG00000162461 23.856120
## 5 ENSG00000163959 40.058762
## TCGA-4N-A93T-01A-11R-A37K-07
## 1 11.98080
## 2 159.79893
## 3 1.61412
## 4 45.54404
## 5 80.00373但是由于我们下载是Count 矩阵基因ID 是 ENSEMBL 号，所以我们需要将其转换为SYMBOL的标识，如下：
############ENSEMBL to SYMBOL
library(org.Hs.eg.db)
library(clusterProfiler)
genes<-exp2$rowname
eg <- bitr(genes,
fromType="ENSEMBL",
toType=c("ENTREZID","ENSEMBL",'SYMBOL'),
OrgDb="org.Hs.eg.db")
head(eg)## ENSEMBL ENTREZID SYMBOL
## 1 ENSG00000142959 266675 BEST4
## 2 ENSG00000163815 7123 CLEC3B
## 3 ENSG00000107611 8029 CUBN
## 4 ENSG00000162461 284723 SLC25A34
## 5 ENSG00000163959 200931 SLC51A
## 6 ENSG00000144410 130749 CPO合并数据，并且去掉重复的基因行，最后获得第一列为基因symbol， 第一行为样本编号，中间数值为TPM，如下：
exp3<-merge(eg,exp2,by.x="ENSEMBL",by.y="rowname",all.x=TRUE)
exp4<-exp3[,3:ncol(exp3)]
exp5<-exp4[!duplicated(exp4$SYMBOL),]
exp5[1:5,1:4]## SYMBOL TCGA-3L-AA1B-01A-11R-A37K-07 TCGA-4N-A93T-01A-11R-A37K-07
## 1 DBNDD1 145.7848372 932.6654
## 2 HSPB6 463.5507914 125.3295
## 3 PDK4 199.3329095 223.2314
## 4 ABCB5 0.7485274 0.0000
## 5 PRSS22 441.2341966 1428.1244
## TCGA-4T-AA8H-01A-11R-A41B-07
## 1 477.12059
## 2 35.59667
## 3 241.33307
## 4 0.00000
## 5 247.16721write.table(exp5,file = "exp.txt",row.names = F,quote = F,sep = "\t")2. CIBERSORT 分析结果
我们必要保证 'Cibersort.R'，'LM22.txt' 和 'exp.txt' 三个文件必须在同一个目录下，并且在同一文件夹下可以得到运算结果（"CIBERSORT-Results.txt"）。Cibersort结果的默认文件名为CIBERSORT-Results.txt，在同一文件夹下进行第二次运算会覆盖第一次得到的文件，建议在每一次运算之后对文件重命名。如果表达矩阵中基因不能完全覆盖LM22.txt中的基因，Cibersort 同样可以正常运行，但不能少于 "LM22.txt" 中所需基因的一半。
一条命令计算完毕，如下：
source('Cibersort.R')
CIBERSORT('LM22.txt','exp.txt', perm = 1000, QN = T) #perm置换次数=1000，QN分位数归一化=TRUE读取结果文件 "CIBERSORT-Results.txt"，我们看下获得的结果，如下：
results<-read.table("CIBERSORT-Results.txt",header=TRUE,row.names = 1,check.names = FALSE,sep="\t")
results[1:5,]## B cells naive B cells memory Plasma cells
## TCGA-3L-AA1B-01A-11R-A37K-07 0 0.01395401 0.03348333
## TCGA-4N-A93T-01A-11R-A37K-07 0 0.03180062 0.11197878
## TCGA-4T-AA8H-01A-11R-A41B-07 0 0.02393778 0.11489327
## TCGA-5M-AAT4-01A-11R-A41B-07 0 0.01961242 0.01678773
## TCGA-5M-AAT5-01A-21R-A41B-07 0 0.03367153 0.10927705
## T cells CD8 T cells CD4 naive
## TCGA-3L-AA1B-01A-11R-A37K-07 0.6226358 0
## TCGA-4N-A93T-01A-11R-A37K-07 0.4945048 0
## TCGA-4T-AA8H-01A-11R-A41B-07 0.5156207 0我们看到后面几列的解释，如下：
Sample：样本
T Cell..：细胞浸润比例
P-value : 置换检验（蒙特卡罗方法），越小越可信
Correlation ：原表达矩阵乘以细胞占比后的数据矩阵与原表达矩阵的相关性
RMSE：均方根误差(Root Mean Squared Error)，越小效果越好。
3. 结果展示
对于肿瘤的免疫浸润分析结果，有多种表现形式，我们这里主要说几种 SCI 文件中常见的图形，如热图，直方图，箱线图等。
2.1 经典的免疫细胞丰度热图
library(pheatmap)
re <- results[,-(23:25)]
k <- apply(re,2,function(x) {sum(x == 0) < nrow(results)/2})
re2 <- as.data.frame(t(re[,k]))
##########构造注释文件
an = data.frame(Group = group$Group,
row.names = group$Sample)
###
#####修改色带，breaks
bk <- c(seq(-15,-5,by=1),seq(-4.9,4.9,by=0.2),seq(5,15,by=1))
pheatmap(re2,scale = "row",
show_colnames = F,
cluster_cols = F,
annotation_col = an,
drop_levels = TRUE,
color = c(rep("blue",11),colorRampPalette(colors = c("blue","white","red"))(50),
rep("red",11)),
breaks = bk,
#legend_breaks = c(-5,-2,0,2,5)
)2.2 直方图
##########直方图
library(RColorBrewer)
library(tidyr)
mypalette <- colorRampPalette(brewer.pal(8,"Set1"))
dat <- re %>% as.data.frame() %>%
rownames_to_column("Sample") %>%
gather(key = Cell_type,value = Proportion,-Sample)
ggplot(dat,aes(Sample,Proportion,fill = Cell_type)) +
geom_bar(stat = "identity") +
labs(fill = "Cell Type",x = "",y = "Estiamted Proportion") +
theme_bw() +
theme(axis.text.x = element_blank(),
axis.ticks.x = element_blank(),
legend.position = "bottom") +
scale_y_continuous(expand = c(0.01,0)) +
scale_fill_manual(values = mypalette(22))2.3 箱式图
#####箱式图
ggplot(dat,aes(Cell_type,Proportion,fill = Cell_type)) +
geom_boxplot(outlier.shape = 21,color = "black") +
theme_bw() +
labs(x = "Cell Type", y = "Estimated Proportion") +
theme(axis.text.x = element_blank(),
axis.ticks.x = element_blank(),
legend.position = "bottom") +
scale_fill_manual(values = mypalette(22))2.4 排序的箱式图
###########排序
library(dplyr)
a = dat %>%
group_by(Cell_type) %>%
summarise(m = median(Proportion)) %>%
arrange(desc(m)) %>%
pull(Cell_type)
dat$Cell_type = factor(dat$Cell_type,levels = a)
ggplot(dat,aes(Cell_type,Proportion,fill = Cell_type)) +
geom_boxplot(outlier.shape = 21,color = "black") +
theme_bw() +
labs(x = "Cell Type", y = "Estimated Proportion") +
theme(axis.text.x = element_blank(),
axis.ticks.x = element_blank(),
legend.position = "bottom") +
scale_fill_manual(values = mypalette(22))2.5 添加分组显著性
############tumor -vs- normal
library(stringr)
library(ggpubr)
dat$Group = ifelse(as.numeric(str_sub(dat$Sample,14,15))<10,"TP","NT")
ggplot(dat,aes(Cell_type,Proportion,fill = Group)) +
geom_boxplot(outlier.shape = 21,color = "black") +
theme_bw() +
labs(x = "Cell Type", y = "Estimated Proportion") +
theme(legend.position = "top") +
theme(axis.text.x = element_text(angle=80,vjust = 0.5))+
scale_fill_manual(values = mypalette(22)[c(6,1)])+
stat_compare_means(aes(group = Group,label = ..p.signif..),method = "kruskal.test")个人感觉总结的已经很全面了，不足的地方请大家指正。
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References:
Newman AM, Alizadeh AA. Determining cell type abundance and expression from bulk tissues with digital cytometry. Nat Biotechnol. 2019 Jul;37(7):773-782. doi: 10.1038/s41587-019-0114-2. Epub 2019 May 6. PMID: 31061481; PMCID: PMC6610714.
Chen B, Khodadoust MS, Liu CL, Newman AM, Alizadeh AA. Profiling Tumor Infiltrating Immune Cells with CIBERSORT. Methods Mol Biol. 2018;1711:243-259. doi: 10.1007/978-1-4939-7493-1_12. PMID: 29344893; PMCID: PMC5895181.
Li B, Cui Y, Nambiar DK, Sunwoo JB, Li R. The Immune Subtypes and Landscape of Squamous Cell Carcinoma. Clin Cancer Res. 2019 Jun 15;25(12):3528-3537. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-18-4085. Epub 2019 Mar 4. PMID: 30833271; PMCID:
Newman, A., Liu, C., Green, M. et al. Robust enumeration of cell subsets from tissue expression profiles. Nat Methods 12, 453--457 (2015).