免疫荧光-实验步骤

细胞爬片免疫荧光：

第一天

1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圆盖片：13mm 24孔；18mm 12孔；20mm 6孔）
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min, PBS浸洗玻片3次,每次5min
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制)室温通透20min (细胞膜上表达的抗原省略此步骤);
4. PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室温封闭30min 5,吸水纸吸掉封闭液,不洗,每张玻片滴加足够量用PBS稀释好的一抗并放入湿盒, 4℃孵育过夜;

第二天:

6. 加荧光二抗: PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗, 湿盒中室温孵育50min。
   注意:从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行.
7. DAPI复染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
8. 封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
9. 镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）。
   两种抗体同时孵育：由于FIT容易萃灭，因此在孵育抗体时后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光