样品的照明是在显微镜和显微摄影的关键实现高品质影像的最重要的变量。科勒照明是由卡尔蔡司公司的奥古斯特·科勒在1893年首次推出为提供最佳的标本照明的方法。
由现代实验室显微镜的所有制造商推荐的这种技术，因为它可以产生标本照明即从眩光均匀光亮和无，从而允许用户实现对显微镜的全部潜力。
制造商已经设计现代显微镜使内置在显微镜的基座集电极透镜和任何其它光学元件将投射灯丝的放大和聚焦的图像投影到一个适当定位台下聚光的孔径光阑的平面。关闭或打开所述聚光镜膜片控制所述光线从聚光镜新兴并到达从所有方位角样品的角度。因为光源不聚焦在样品的水平，在检体水平的光基本上是grainless和扩展和聚光镜的玻璃表面上不会受到灰尘和瑕疵的恶化。聚光镜孔径光阑的开闭控制角的光锥到达样品。聚光镜的孔径光阑的设置，与物镜的口径一起确定显微镜“系统” 实现的数值孔径。作为聚光镜光圈被打开，在显微镜的工作数值孔径增大，产生更大的分辨能力和光透射率。穿过并照亮样品平行光线被带到聚焦在物镜，其中所述可变电容器孔径光阑和光源的图像的图像将在焦点中可以看出的后焦平面。
在图1所示的光通路被示意性绘制以表示由检体照射光射线和成象光线采取不同的路径。这不是这些途径的任何实际偏析的真实再现，但提出了用于可视化和讨论的目的的示意图。图1（a）示出了用于照明光在台下聚光器孔径光阑，物镜的后焦面的平面产生的灯丝的聚焦图像的射线路径，并且视点（也称为冉斯登盘）目镜。是在共同焦点这些区域通常被称为共聚面 ，这是实现正确的科勒照明至关重要。根据定义，一个对象，它是在聚焦在一个平面上也是焦点在该光路的其他共聚平面。在每个光通路（包括图像形成和照明），有四个分开的平面，它们一起构成了共聚面集合。
共聚面在科勒照明的照明光（图1（a））包括的路径：
灯丝。
聚光镜孔径光阑（在聚光镜的前焦面）。
物镜的后焦平面。
视点目镜（也称为拉姆斯登片），其位于大约二分之一英寸（一个厘米）的目镜的顶端透镜上面，在那里的观察者置于观察时的眼睛的前部的点。
同样地，在图像形成光路中的共聚面中科勒照明（图1（b））包括：
视场光阑。
聚焦标本。
在中间像平面（即，目镜的固定光阑的平面）。
眼睛的视网膜或照相机的胶片平面。
共聚焦平面通常在故障排除在光学元件污染灰尘，纤维和不完善的显微镜是有用的。 如果这些文物是在大家关注的焦点，因此，它们必须驻留或表面，形成影像集共聚平面的一部分附近。 该组的成员包括在显微镜的光端口玻璃元件，样品，在目镜标线片，和目镜的底部透镜元件。 另外，如果这些污染物是模糊和失焦，寻找他们的照明组共享共聚平面元素的附近。 这一类嫌疑犯是聚光顶端透镜（其中灰尘往往积累），暴露的目镜透镜元件（从睫毛污染物），和物镜前透镜（通常指纹污迹）。
图2示出一个典型的显微镜设置，其中在灯壳体（照明源）是通过在显微镜基镜面反射后连接到基座和投射光通过几个透镜，然后通过台下聚光镜。光源本身应前中心或定心到显微镜的光轴。从钨 - 卤素灯灯丝发射的光首先穿过靠近灯室内，然后通过更接近视场光阑的第二透镜的集光透镜。通常，烧结或磨砂玻璃滤波器被放置在灯和集电极透镜漫射光，并确保照明的均匀强度之间。在实践中，灯丝的图像聚焦到聚光器的前焦面，而在扩散玻璃被暂时从光路中移除。集电极透镜的焦距必须小心地匹配于灯丝的尺寸，以确保适当大小的一个灯丝图象被投影到聚光镜孔。为适当的科勒照明，灯丝的图像应完全填满聚光镜光圈。
在光路中的第二透镜被称为场透镜，它负责使灯丝的图像聚焦在台下聚光器孔径光阑的平面。聚焦光离开场透镜是通过视场光阑的反射镜（定位在45度角的光路），并进入台下聚光反射。视场光阑用作光为显微镜的虚拟源及其图像被聚光到样品平面聚焦。对于这些元件的布置的光学设计可以通过显微镜的制造商而变化，但场光阑应在从场透镜足够的距离被定位以从在样品的平面被成像消除灰尘和透镜的缺陷。
在显微镜的基视场光阑只控制的光线到达聚光镜束的宽度-它不影响光学分辨率，数值孔径，或照明的强度。视场光阑的适当的调整（即，在光路中心和打开以位于外面的视场）是用于防止眩光重要比可以减少所观察到的图像中的对比度。试图图像样本与固有的低对比度时过量的光的消除是特别重要的。当视场光阑打开太多，从样品散射的光始发和反射光从光学表面倾斜角度可起到降低图像质量。
台下聚光镜通常直接安装在一个支架上的显微镜载物台，可以通过旋转滚花旋钮升高或阶段的独立地降低，如在图2中孔径光圈被打开说明和任一摆臂封闭的下方，一杆，或由聚光壳体上旋转的轴环。应当指出的是，台下聚光镜正确调整可能是实现正确科勒照明的最关键的方面。 然而不幸的是，聚光镜偏差和调整不当聚光镜孔径光阑的图像退化和显微摄影质量差的主要来源。
当适当调整，从聚光镜的光将通过投影光锥来照明视场填补成象光的物镜的后焦平面（的详细讨论台下聚光镜被包括在引物的另一部分）。聚光镜孔径光阑是负责控制照明光锥的角度，因此，在数值孔径的聚光的。这个概念在图3中，其中的一系列聚光镜与减小尺寸从左至右在图中的光锥（和数值孔径）示出说明。聚光光锥形状也校正所证明在下面的交互式Java教程的光学像差的程度的函数：
图3（a）表示数值孔径约1.20，因而具有广阔的光锥可以与高数值孔径物镜的标本摄像装置的聚光镜。 图3（BD）显示如何减小孔径光阑的大小会产生光锥的尺寸和数值孔径（如图3（b） NA = 0.60的相应减少;如图3（c） 的NA = 0.30;图3（d ）NA = 0.15）。 我们还构建了一个交互式Java教程演示聚光光锥的大小和形状如何随数值孔径的变化而变化。
要注意，对于大小和聚光镜光锥的形状是很重要的，这减少了视场光阑的大小仅用于略微减小光锥的在图3中的角度和数值示出的下部的尺寸光锥的光圈依然有减少视场光阑的大小基本保持不变。另一个重要的概念，通常由新手忽视，是照明的强度不应通过开闭聚光镜孔径光阑，也不是由相对于轴向移动聚光镜到显微镜的光学中心的控制。光照强度应该只通过使用放入光路的中性密度过滤器或通过降低电压到灯（尽管后者通常不推荐的，尤其是对显微摄影）来控制。以确保钨卤素灯的最大性能，指的是制造商的仪器手册，以确定最佳的灯电压（通常为6-10伏特），并使用该设置。照明亮度然后可通过添加或移除中性密度滤波器来容易地控制。
台下聚光镜孔径光阑的尺寸不应该只与所需的数值孔径一致，而且所产生的图像的质量应予以考虑。 通常，孔径光阑应调整，以提供足够的图像的对比度而不被关闭，以引入分辨率和细节的损失的点。 折射率和固有标本对比度是确定孔径光圈的尺寸非常重要的。 在一般情况下，光圈应设置的位置，使整个光盘大小的60％至90％（在除去目镜一个伯特兰透镜或后眼管可见），虽然这可能与在样品相反的极端变化。
上通过显微摄影捕获的图像的质量聚光镜光圈设置的影响在图4中示出的检体是椴树（椴）的薄部干染色用固绿和曙红，并用40倍平场消色差物镜上FUJICHROME 64T透明胶片拍摄（NA = 0.75）和摆动出顶级镜头消色差聚光镜（NA = 0.90）。 近似聚光镜光圈开口设置有：如图4（a） - 90％的（NA = 0.81）; 如图4（b） - 60％（NA = 0.54）; 图4的（c） - 20％（NA = 0.18）。 该组织部分选择颜色染色透露细节和分化子细胞成分观察。
在如图4（a），其中孔径光阑被设置在其中，聚光镜和物镜的数值孔径是几乎相等的位置处，大部分的细样品的细节是可见的，尽管仍然存在着相当量的散射和眩光。图象也比其对应，将其用孔径光阑的较小设置所做显著亮。图4（b）示出在大约产生的数值孔径的70％，该物镜的聚光镜孔径大小的椴树茎。眩光降低，图像非常清晰，精细的图像细节存在不显著衍射文物。对于这种样品，图4中的显微照片（b）表示用于聚光镜孔径光阑的最佳设定。当光圈是在物镜的数值孔径为约25％的封闭的最小设定（图4（c）），精细的图像细节变得模糊不清与衍射伪像和折射现象。图像也需要对产生的样品的颜色色调的变化较暗整体铸造。这个概念可以更详细地使用在台下互动式Java教程探索聚光镜孔径光阑 。
从上面的讨论很明显，聚光镜的孔径光阑应设置的位置，将提供依赖，在相当大的程度，对样品的吸收，衍射，以及折射特性直接和偏离的光的折衷混合物。这必须没有与文物，晦涩的细节和对比度当前错误增强铺天盖地的图像来完成。图像细节和必要，以产生最佳显微照片对比度的量还取决于折射率，光学特性和其他检体相关的参数。
当孔径光阑被错误太多闭合，偏离光开始模糊直接照射光线，产生衍射伪像导致可见条纹，带，和/或在显微照片图案形成。其他的问题，比如折射现象，也可以产生的图像中的明显的结构，这是不实际。或者，打开聚光镜光圈太宽导致从内镜下标本和光学表面多余的眩光和光散射。这导致对比度和清洗的显著损失出的图像的细节。正确的设置将样品而异标本，并且经历显微镜将很快学会通过观察图像精确调节聚光镜孔径光阑（和系统的数值孔径），而无需在物镜的后焦平面，以查看振动板。事实上，许多显微镜认为显微镜系统，以优化图像质量的数值孔径的临界还原是在显微摄影的一个最重要的步骤。
显微镜的照明系统中，当调整适当的科勒照明，必须满足几个要求。样品平面的照射区域必须至少为视图对于任何给定物镜的数值孔径一样大。另外，光必须是均匀的强度的和数值孔径必须从最大值（等于物镜的）来表示将取决于样品的光学特性的最小值而变化。表1包含物镜的数值孔径与视图视场（对于场号18的目镜）的每个物镜，范围从非常低到非常高的放大倍率的列表。
平场消色差平场消色差平场消色差平场消色差平场消色差平场消色差平场消色差平场复消色差透镜平场复消色差透镜平场复消色差透镜
指定物镜数字
光圈查看直径场
1X0.0418.0
2倍0.069
4倍0.104.50
5倍0.153.60
10倍0.251.80
20倍0.400.90
40倍0.650.45
50倍0.900.36
60X0.950.30
100X1.400.18
表格1
从表1中呈现的数据，很明显，鉴于视场直径的变化是100倍来自1x 平场消色差到100倍平场复消色差透镜。这产生在1x和100倍的物镜之间的照明的区域惊人10,000倍的差异。这种宽范围的照明区域的需要，以适应所有的倍率调整在光路许多组件。这些计算是在假定18的目镜场号，但许多现代显微镜配备有具有20个或25视图视场的场数大视野目镜（如表1中的三栏给出）可以被重新计算为任何目镜使用下面的公式：
D =（FN）/ M
其中D是视场的直径，FN是目镜场数，M是的物镜放大倍率。
现代显微镜配备有具有一个开式透镜，其可以从（通过5倍2倍），用于与低倍率的物镜用途的光路中移除专门台下聚光镜。这改变了光路的其余部件的性能，并且一些调整是必要的，以达到最佳的照明条件。视场光阑不能再用于台下聚光器的对准和居中并且现在是在限制在照明下的样品的面积是无效的。此外，大部分不希望的眩光一旦通过视场光阑除去的降低，因为在聚光镜的顶部透镜产生具有低得多的数值孔径的光锥，允许光线穿过样品在低得多的角度通过。最重要的是，科勒照明光学条件不再适用。
显微镜的光学元件和建立科勒照明条件下的走线应始终处于较高（10倍）的放大倍率在较低的去除工作外摆式聚光镜（5倍及以下）的放大倍率前进行。聚光镜的高度应然后不被改变。当摆式取下镜头，聚光性能彻底改变。灯丝的图像不再形成在孔径光阑，该停止控制聚光镜和照明系统的数值孔径。事实上，孔径光阑应完全打开，以避免渐晕，光在视场的边缘逐渐褪色。
在低倍率显微镜系统为透过光的改性光通路在图5中所示的视场光阑现在定位在正确的平面作为孔径光阑，以控制数值孔径的光锥的尺寸和形状照明和成象光线穿过聚光镜。装入物镜，而不是后焦面的检体平面与等角圆锥（如在科勒照明），但是灯丝现在成像在后透镜充分照射。
值得注意的是，视场光阑的图像不再形成在样品平面上，虽然照明的整体强度仍然在视野内均匀，设置在灯的聚光透镜稍微扩散（化学蚀刻）或磨砂是很重要。在低倍显微镜视场光阑的新职务是一个的话题交互式Java教程的标本对比度调整在低倍率。
在低倍显微镜对比度调整用高倍率的物镜是类似的程序，如在图4所示。当视场光阑是敞开的（大于80％），样品细节洗出和散射的一个显著量和眩光当下。闭视场光阑到位置50和80％之间将产生关于样品的对比度和景深的最佳折衷。专为低倍率的物镜是在设计上比他们更高的放大倍率同行显著简单。这是由于照明由低倍率聚光镜，其需要较低的数值孔径的物镜产生的光锥的小角度。
测量标线片，它必须是在锐聚焦的并叠加在样品的图像上，可以插入到几个上面讨论的共聚平面。最常见的目镜（眼）测量和显微摄影掩模版被放置在中间像平面，这是目镜内的固定光阑。这在理论上是可能的也放置掩模版在样品平面或在照明场膜片的平面。阶段微米是专门“掩模版”放置在测微尺，其用于校准目镜标线片，并以使样品的测量。放置掩模版中的视场光阑的平面从未做过（据我们所知），将需要非常高的校正的聚光镜用于像差完全消除伪像和用于测量提供鲜明的图像。
彩色和中性密度滤波器常常放置在光学路径中，以减少光强度并改变照明的颜色特性。有显微镜支架，其中这些过滤器通常被放置在多个位置。一些现代实验室显微镜具有夹在灯壳和集光透镜，作为对这些过滤器的理想位置之间的过滤器支架。通常情况下，用色彩校正滤镜和磨砂扩散过滤器沿着中性密度滤镜放在一起在这个过滤器支架。其他显微镜的设计提供一组内部构建成可以通过一个杠杆装置被切换到光路径主体的过滤器。为过滤器的第三公共位置是安装在台下聚光镜底部，比孔径光阑显著下，将接受的明胶或玻璃过滤器的保持器。
不放置过滤器内或附近的任何图像形成共聚平面的，以避免在过滤器上的灰尘或表面缺陷与样品一起待成像是非常重要的。有些显微镜对在该基地将过滤器附近的光口（近场光阑）的附件。这个位置可能是太靠近视场光阑，和表面污染可能是在大家关注的焦点，或出现叠加到图像模糊伪影。这也是不明智的直接放在过滤器在显微镜舞台出于同样的原因。
来源：https://www.tengrant.com/content/?618.html