直播答疑 | 细胞培养问题解析

细胞培养问题一直都是关注的热点，在9月15日开播的“细胞培养问题解析”课程中，有很多老师就细胞培养问题提出了疑问。我们筛选出部分代表性问题，并作了详细解答。

01

细胞膜上有些小黑点是正常的吗？

细胞表面并非完全光滑的，细胞表面的一些胞吐小泡或者突起在显微镜下都是黑色小点的形式。

02

无血清培养是用什么提供营养呢？

无血清培养也会添加一些血清的替代物类添加剂，比如B-27等。

03

THP-1冻存前细胞都是圆圆的，冻存复苏后细胞形态就不圆了，细胞中间有空泡是怎么回事？

可以通过台盼蓝染色的方式确定细胞是否为活细胞，如果是死细胞，后期传代过程会被淘汰掉。

04

THP-1细胞不够圆是状态不好的标志吗？

THP-1正常培养状态较好时，应是圆形透亮的细胞；刚复苏或活力不佳、状态不好时，可能会有表面出现小颗粒的情况，应该是细胞受到外界刺激分泌物增加的原因。

05

据说把培养瓶竖起来细胞会长得快？

培养瓶竖起来是为了增加局部细胞密度，有利于细胞恢复和增长，常用于解决悬浮细胞密度低的问题。

06

想问一下EDTA浓度用多少啊？我浓度用到0.2%也消化不下来。

我们实验室常用的浓度是2.5g/L胰蛋白酶加0.2g/L EDTA。

07

培养大鼠视网膜muller时，死细胞多怎么处理？

大鼠视网膜muller为贴壁细胞，一般死细胞不能贴壁，换液去除即可。

08

肿瘤细胞内有空泡，却可以正常传代，是什么原因？

细胞产生空泡有的是正常形态，比如caco-2细胞，就是有空泡，没有办法去除，有的之前没有空泡，短期突然急剧增多，可能是环境改变后的应激反应，换回以前的培养环境就好了，或者细胞适应以后空泡就会消失。

09

可以再讲一下细胞的分步消化吗？

贴壁细胞传代分次消化操作（用于比较难消化的细胞）：

吸出原培养液；

加入2ml左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸出PBS丢弃；

加入1ml左右胰酶，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞；

放入培养箱消化，消化3~5分钟，显微镜下看到细胞开始漂浮，可以加入2mLPBS，晃动培养瓶使细胞悬浮，不要吹打剩下的贴壁细胞；

吸出培养瓶内的PBS和细胞悬液，转移到无菌离心管中，在离心管中加入3mL含血清的培养基终止消化并吹散细胞，使细胞尽量呈单颗细胞的状态；

原培养瓶中加入0.5mL胰酶，晃动培养瓶浸润细胞，放入培养箱继续消化，直到细胞块中间全部收缩变圆，晃动培养瓶可脱落；

用3mL含血清的培养基终止消化，将瓶底的细胞全部吹下，并反复吹吸分散细胞呈单颗；

收集细胞悬液与第一次消化下来的细胞合并到一个离心管；

离心收集细胞沉淀，1200rpm/min 3分钟，离心完吸出上清丢弃;

加入新鲜培养基，吹打几下混匀细胞即可，按需接种到新培养瓶，补足培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养;

检查培养箱中的二氧化碳浓度、温度和水盘。

10

细胞之间有小黑点，做布朗运动，小黑点会变多，但是细胞仍能正常生长，是黑胶虫吗？还是细菌呢？怎么处理比较好呢？

像一些血清的蛋白沉淀、细胞小碎片等，在显微镜下看都是小黑点，由于是悬浮在液体里面的，所以会做布朗运动。区别于黑胶虫或者细菌的话，可以通过增长速度来区分，一般活物是会繁殖，会倍增，碎片之类的会逐渐沉淀，不会快速倍增；更直观的方法是通过接琼脂板或者革兰氏染色来区分是否为其他微生物污染。

11

THP-1诱导干预后怎么消化下来？特别难消化，消化两次都不能完全消化下来。

THP-1诱导分化为巨噬细胞之后会变为终末分化细胞，不会继续增殖，一般建议分化完直接做实验，如果要转移可以用细胞刮，或者参考巨噬细胞的处理方法，用利多卡因进行处理。

12

细胞密度低是不是细胞形态会受到影响？

低密度细胞形态相比高密度是会有区别的，一般形态会更细长一点，密度高一点就改善了。