DNA甲基化Bismark、BSMAP流程跑起来

日常掰虾

  前面学习了DNA甲基化的基础知识,也了解了它的重要性,不知道的同学看这里,DNA甲基化知识概述。既然这么重要,我们当然要知道怎么处理数据了。不能只会理论不懂实践啊,像我这样只能靠脑袋以下为生的人肯定要会操作了。
  毕竟!
  不是有一句话说的很有道理么!
  纸上得来终觉浅,觉知此事要躬行!
  只能找这样的话来安慰自己让自己心安理得的干活了。废话说完,继续来说DNA甲基化。前面说过目前分析DNA甲基化的是以亚硫酸盐转化的测序技术(BS-seq),如全基因DNA甲基化测序(Whole Genome Bisulfite Sequencing)和DNA甲基化靶向测序(Reduced-representation bisulfite sequencing),这两者从技术上来讲没有本质的区别,只不过后者多了一步富集的步骤,即靶向富集一些甲基化区域,达到控制成本和分析质量的目的。现在分析BS-seq可供选择的软件不少,主流的有两款Bismark和BSMAP。虽然这两个软件都是用来分析BS-seq的软件,但工作原理却大相径庭。

  测序 DNA BS 转化后经过 PCR 扩增发生了 C->T 转化,那么反向互补链则是 G->A 转化。普通DNA文库经过PCR扩增会生成正负2种链,并且这两条链是反向互补的,而经过亚硫酸盐处理后,DNA链由于C->T的转换导致两条链并不互补,所以经过PCR扩增后会形成正负4种链,即所谓的OT、CTOB、OB、CTOB。

  Bismark 是一款比较有名的甲基化测序比对软件,Bismark 比对前会将所有 reads 进行 C->T 和 G->A 转换,并且将参考基因组同样进行这 2 种转换。非链特异性建库reads的方向无法确定,则转换后的2种reads要分别与参考基因组的2种情况分别进行比对,相当于每条 reads 进行 4 次不同比对,从里面选择最佳比对作为结果。如果是链特异性建库由于已知reads的属于哪一条链,则会只比对两种情况,这样比对速度上要很多。由于Bismark会将reads和参考基因组做C->T或G->A转换,就某一种情况来说转换后只剩下3种碱基,故Bismark的工作原理又被俗称为“三碱基比对”。

  BSMAP是另外一款比较有名的甲基化测序比对软件,采用“wild-card”策略进行比对,简单来说就是用参考基因组创建“Seed Table”,每一个seed中的每一个C都有可能是甲基化的C或非甲基化的C,故在“Seed Table”中包含C->T转换的全组合,然将reads与“Seed Table”比对,选择最优的一种比对情况。

  Bismark和BSMAP都是使用率比较高的软件,前面比对速度稍慢,但功能比较全面可以直接得到甲基化表格,而后者只是一个比对软件,速度上会快些,但需要结合甲基化提取软件来使用。选择哪一款结果都是可以被别人认可,具体选择哪一款自行决定吧!

搬砖姿势

  上面说了那么多理论,下面就是如何搬砖了,看看具体如何使用软件来处理这样的数据。

Bismark

1、安装

wget https://github.com/FelixKrueger/Bismark/archive/0.22.3.tar.gz
tar -xzf 0.22.3.tar.gz
#为使用方便将Bismark路径添加到环境变量
export PATH=$PWD/Bismark-.22.3:$PATH

2、在参考基因组存放目录,运行如下命令:

bismark_genome_preparation genome.fasta

3、使用

bismark -p thread --rg_id prefix --rg_sample prefix --basename prefix -o align --genome_folder genomedir read 

sambamba sort --natural-sort -m 8GB --tmpdir temp_dir -t thread -o align/prefix_nsort.bam align/prefix*.bam

bismark_methylation_extractor -p --comprehensive --bedGraph --gzip --genome_folder genomedir --multicore thread -o call align/prefix_nsort.bam

去重复视情况而定,WGBS 需要进行去重,RRBS 不需要去重。

deduplicate_bismark --paired --outfile prefix --output_dir dedup prefix*.bam

BSMAP

#安装
wget https://github.com/genome-vendor/bsmap/archive/refs/tags/v2.42.tar.gz
tar -zxf v2.42.tar.gz
cd bamsp-2.4
make
make install

#比对
bsmap \
-a fastq_R1 \
-b fastq_R2 
-d path/hg19.fa \
-p 5 \
-v 0.05 \
2>report/BSMAP_report.txt | \
samtools view -b \
-o align/align.bam

#排序
sambamba sort \
-m 8GB \
--tmpdir tmp \
-t 5 \
-o prefix_sorted.bam align.bam

#去重
sambamba markdup \
--overflow-list-size 1000000 \
--tmpdir tmp \
-t 5 \
prefix_sorted.bam \
dedup.bam \
2> markdup_report.txt

#提取甲基化
MethylDackel extract \
path/genome.fa \
dedup.bam \
--opref prefix

  参数有点多,这里不解释了,可以使用软件的help查看解释。PS:MethylDackel是一款提取甲基化的软件,需要自行安装才能使用。

搬完收工

  上面介绍了两款比较出名的DNA甲基化处理工具,大家可以自己选择用一个,不必纠结选择哪一个,能解决问题就可以了。今天就分享到这里了~~~

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