单细胞文献9-单细胞分析支气管肺泡灌洗液区分轻度和重症COVID-19

来源

Discriminating mild from critical COVID-19 by innate and adaptive immune single-cell profiling of bronchoalveolar lavages

影响因子： 20.507

PMID：33473155期刊年卷：Cell Res2021 Jan 21; 生物一区 细胞生物学 Q1 10/190

DOI：10.1038/s41422-020-00455-9

思路

作者，分析了31例轻度或重症COVID-19患者的支气管肺泡灌洗（BAL），纳入13例非COVID-19的患者。

1. 与非COVID-19肺炎和正常肺的BAL相比，对5例轻度和26例重症COVID-19患者的支气管肺泡灌洗（BAL）样品进行了单细胞深度免疫分析。使用拟时序推断来构建T细胞和单核细胞到巨噬细胞的轨迹，并沿它们模拟基因表达变化。

2. 在轻度COVID-19中，CD8 ⁺T _RM和CD4 ⁺ T-helper-17（T _H17）细胞在拟时序末端经历主动的（可能是抗原驱动的）扩增，并具有良好的效应子功能，而在重症的COVID-19中，它们仍较原始。

3. 反之亦然，具有T-helper-1特征的CD4 ⁺ T细胞（类似T _H1）和表达耗尽标记的CD8 ⁺ T细胞（T _EX样）在轻度COVID-19中的轨迹中途富集，在那里它们也表现出良好的效应子功能，而在重症COVID-19中，它们在轨迹结束时显示出与炎症相关的压力的证据。

4. 单核细胞到巨噬细胞的轨迹显示，慢性高炎症性单核细胞富集重症的COVID-19，而肺泡巨噬细胞则以抗炎和抗原呈递特征为特征而被耗尽。

5. 在重症的COVID-19中，单核细胞有助于产生ATP-嘌呤，从而使COVID-19相关的纤维化和疾病重症程度恶化。

6. 最后，病毒RNA跟踪揭示了感染的肺上皮细胞以及参与病毒清除的大量嗜中性粒细胞和巨噬细胞。

结果

1. ScAL-seq和BAL样品的细胞分型

22例住院患者的BALSARS-CoV-2的qRT-PCR阳性,13例SARS-CoV-2阴性（non-COVID-19），分“轻度”和“重症”疾病组,对BAL样品进行scRNA-seq处理。过滤后，65,166个细胞中检测到了150多个基因，获得了约1.86亿个独特的转录本。其中，约51％的细胞来自COVID-19。

降维和聚类的分析聚类（图1a）：

淋巴样细胞CD4 ⁺和CD8 ⁺T细胞，

自然杀伤细胞（NK），

B细胞和浆细胞，

髓细胞（单核细胞/巨噬细胞，嗜中性粒细胞，肥大细胞，浆细胞样树突状细胞/ pDC和常规树突状细胞/ cDC）

上皮细胞（包括分泌性，基底，纤毛，鳞状，炎性和AT2肺上皮细胞）

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作者整合其他几个数据集后，数据来自5位轻度和26位重症的COVID-19患者，并与10位轻度和3位重症的非COVID-19患者进行了比较。从数量 上看，单核细胞/巨噬细胞和嗜中性白细胞是最丰富的细胞类型，共占COVID-19细胞的65.7％（n = 55,825）（图 1c）。

在评估这些细胞类型的相对富集或耗竭时，作者发现与非COVID-19患者相比，COVID-19患者中单核细胞和中性粒细胞的发生率更高，尤其是在重症患者中（图 1c；图S 1i）。

COVID-19中的巨噬细胞和上皮细胞较少，特别是在重症患者中。CD8 ⁺T细胞和NK细胞略微富集，主要发生在轻度疾病中。比较轻度和临界COVID-19时，前者中CD8 ⁺ T细胞，巨噬细胞和cDCs有所增加（图 1d）。

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2. COVID-19 BAL中CD8 ⁺ T细胞的表型异质性

1. 作者总共检索了23468个T细胞和NK细胞，将其亚簇化为14个表型（图 2a-c；，图S 2a-c）。为了避免增殖性T细胞单独聚集，作者在此分析中针对细胞周期基因进行了回归分析（请参阅材料和方法）。
2. 确定了7个CD8 ⁺ T细胞簇，5个CD4 ⁺ T细胞簇和2个NK细胞簇。

1.naïve CD8⁺ T-cells (T_N) :CCR7，LEF1和TCF7

2.effector-memory（T _EM ):GZMK，GZMH，GZMM

3. exhaustion-like T-cells (T_EX):GZMA，GNLY，GZMB，IFNG

T _EX细胞定义衰竭的免疫检查点:HAVCR2，CTLA4，LAG3

4.CD8⁺ resident-memory T-cells（T _RM）: ZNF683和ITGAE

5.CD8⁺recently-activated effector-memory T-cells （T _EMRA; CX3CR1，FGFBP2，FCGR3A）

6.identified mucosal-associated invariant T _MAIT: SLC4A10，PRSS35，CCR6

7.gamma-delta T _γδ 细胞: TRDC，TRGC2和TRG-AS1

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图2：轻度和重症COVID-19 BAL中的14种T细胞表型

接下来，作者评估了COVID-19与非COVID-19疾病中每种T细胞表型的患病率，但未观察到CD8 ⁺表型的差异（图 2d；，图S 2d）。当比较轻度和临界COVID-19时（图 2e），作者发现T _MAIT细胞在前者中略有增加。

但是，对于CD8 ⁺ T _RM细胞，轻度与临界COVID-19的增加最大。为了理解这种差异，作者使用了Slingshot来推断拟时序轨迹（不包括T _MAIT-和_Tγδ-细胞）。作者观察到3个不同的轨迹（图 3a）：CD8 ⁺ T _N-细胞与T _EM-细胞连接，随后分支为3个不同的谱系，即T _RM-细胞，T _EX-细胞和T _EMRA -细胞，几乎所有CD8 ⁺ T _N-细胞（99.6％）被所有3条轨迹共享（，图S2e）。标记基因，抑制性检查点，细胞毒性标记和沿着这些轨迹的增殖的谱图证实了它们的功能性注释（图 3b，c）。值得注意的是，除了增加抑制性检查点和细胞毒性标记物的表达外，CD8 ⁺ T _EX细胞的特征还在于增殖（，图S 2f），G2M和S基因得分沿轨迹逐渐增加（图 3b，c）。接下来，沿着这些轨迹创建反映每种表型状态下T细胞相对数量的密度图（图 3d），并针对正常组织，非COVID-19和轻度或重症COVID-19进行分层。非COVID-19 T细胞在T _RM谱系末期富集，而在COVID-19中，T _EX谱系就是这种情况（图 3e）。相反，在T _EMRA末期，细胞向正常肺富集。当比较轻度和临界COVID-19时，来自T _RM谱系的细胞在轻度COVID-19的谱系末尾富集，而沿着T _EX谱系，这种富集对于临界COVID-19最为突出（图3f）。

3. COVID-19 BAL中CD4 ⁺ T细胞的表型异质性

幼稚CD4 ⁺ T细胞（T _Ñ ; CCR7，TCF7，LEF1）

效应记忆T细胞（T _EM ; GZMH，GZMK，ANXA1）

CD4 ⁺ T辅助1状（T _H1样）细胞表达T _H1样转录因子（TBX21，RUNX3）免疫检查点（HAVCR2，LAG-3 ，PDCD1和CTLA4）和

细胞毒性基因（NKG7，GZMB，GNLY，PRF1）以及

CD4 ⁺ T-helper-17（T _H17 ; RORC，IL17A / F，CCR6，IL23R）和

CD4 ⁺调节性T细胞（T _REG ; FOXP3，IL2RA，IKZF2）（图 2c ;图S 2b）。

与非COVID-19相比，作者在COVID-19中观察到的CD4 ⁺ T _H17-细胞略少，但更多的T _H1 -like细胞。比较轻度和重症COVID-19，作者发现T _H1样细胞在后者中显著增加（图。 2d，e）。

CD4 + T _REG细胞可以进一步分为两个表型（TNFRSF9^高和TNFRSF9^低；，图S 2k，l），但是由于它们复杂而独特的发育过程，作者在随后的轨迹分析中将其排除了。

拟时序的表型异质性，识别中央记忆CD4+T_CM 细胞和干细胞样记忆CD4+T _SCM 细胞（图 4a，b）。共有3条轨迹，这些轨迹是基于共享的TCR克隆型独立确定的（图 4c）。

简言之，T _N 细胞和T_CM 细胞紧密相连，接着为T _EM 细胞，其支断为3个不同的轨迹，以形式为T _H1样，T _H17 -和T _SCM 细胞（图S2m）。

沿着这些轨迹分析标记基因，抑制性检查点，细胞毒性和转录因子证实了它们的功能注释（图 4d）。

CD4 ⁺ T _H1样细胞的特征是沿着其轨迹增加增殖，细胞毒性和抑制性检查点的表达（图 4d，e ; 图S 2f）。

沿着这些轨迹的密度图显示，COVID-19在T _H1样和T _SCM轨迹的早期和晚期富集了T细胞，反之亦然，在非COVID-19和正常肺中，它们在这些轨迹的中途富集了（图 4f）。

在T _H17轨迹中，COVID-19 BAL在轨迹的前半部分中大量富集T细胞。总体而言，来自轻度COVID-19的CD4 ⁺ T细胞的行为与正常肺或非COVID-19 BAL相似（图 4f-g）。

从COVID-19沿T _H1样谱系，TCR富集度和均匀度均降低，但非COVID-19沿TH1样谱系降低（图 4h）。

值得注意的是，这种减少在重症的COVID-19中最为显著（图 4i）。

相比之下，T _H17细胞和T _SCM细胞的特征是仅在其轨迹的最后才适度降低TCR富集度，这表明，主要针对特定SARS-CoV-2 PAMPs / T _H1样细胞的选择是抗原。

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图4：轻度和重度COVID-19 BAL中的CD4 ⁺ T细胞发育轨迹

总体而言，轻度COVID-19的特征是类T _H1细胞在其轨迹的一半处发生纠缠，而在重症COVID-19中，T _H17细胞则被阻滞在其轨迹的前半部分。

4. CD4+TH1和TH17谱系的基因表达建模

沿着这些CD4+T细胞轨迹的差异基因表达分析确定了几个基因集。在类似T _H1的轨迹中，

第一个基因集由幼稚（LEF1，TCF7）和未分化的（CCR7，S1PR1）T细胞标记组成（图 4j；表 S7）

第二组富集促炎和抗炎标记（CXCR4，CXCL2，ANXA1，SOCS2，LTB）

第三组通过类似效应子的T _H1表征（轨迹的一半）IFNG，颗粒酶（GZMA，GZMK，GZMB），CXCR3，PRF1，NGK7，CCL5以及CTLA4和HAVCR2

第四组高HLA表达，自动调节标记（LGALS1，CCL3），部分激活标记（CXCL13）和应激反应标记（PDIA6，HSBP1，VDAC3，PARP1）表示在运动轨迹的末尾，提示促炎和抗炎表型与早期应激调节的复杂混合。

第五组到线粒体应激（LDHA，PKM，COX17，VDAC1，COX8A），与IL2戒断相关的应激表型（MT1E，MT1X），蛋白毒性应激（PSMB3 / B6 / D4 / A7 / C3，HSPB11，PARK7，EIF4EBP1）和糖酵解（PGAM1）提示在T _H1样轨迹的末端出现“耗竭” 。

在轻度COVID-19中，T_H1样谱系的特征在于组2基因的表达增加，表明T _H1效应子功能增加。在重症的COVID-19中，组4-5个基因的表达占主导地位，表明存在重症的失调（图S 2n）。

在T _H17谱系中，作者还鉴定了5个基因集（图 4k；表 S8）：在轨迹的早期具有高表达的前2个集不表达指示T _H17功能的标记。其余3个在轨迹末端高表达的基因组的特征在于T细胞效应子功能（组3：PDCD1，CCL5，CXCR2，CCR2和GZMA / B），细胞毒性活性基因的表达（组4：NKG7和PRF1）和T _H17细胞相关的白介素（第5组：IL17A，IL17F，IL23R以及IFNG和CCL4）。

值得注意的是，在轻度COVID-19中，细胞的特征在于3–5组基因的表达增加，而重症患者则表现出1–2组基因的表达（图S 2o）。

表明轻度COVID-19的特征在于改善的T _H1和T _H17 功能。T _H1细胞和T _H17细胞的组合作用通过增强，平衡和调节彼此的活动和持久性来调节针对病毒感染相关炎症的免疫反应。

5. COVID-19 BAL中单核细胞向巨噬细胞分化的轨迹

在来自BAL的63114个单核细胞中，作者鉴定出9个表型（图 5a）。单核细胞根据巨噬细胞标记物（CD68，MSR1，MRC1）和单核细胞标记物（IL1RN，FCN1，LILRA5）分开聚集。单核细胞可以进一步分为FCN1^高，IL1B^高和HSPA6^高单核细胞（图 5b；图S 3a），其特征在于经典单核细胞标志物（IL1RN，S100A8 / 9）的表达，促炎性细胞因子（IL1B，IL6，CCL3，CCL4）和热激蛋白（HSPA6，HSPA1A / B）。

作者观察到与非COVID-19相比，COVID-19中的FCN1^高和IL1B^高的单核细胞显著增加，尤其是在重症疾病中（图 5c；，图S 3c）。反之亦然，在轻度和重症疾病比较中，FABP4^中等和FABP4^高泡型肺泡巨噬细胞的COVID-19均降低，尽管无统计学意义。在轻度和临界COVID-19中，FCN1^高单核细胞显著减少，而肺泡巨噬细胞增加（图 5d）。排除应激诱导的表型（HSPA6^高单核细胞和MT1G^高巨噬细胞），作者使用拟时序 重建了两个单核细胞到巨噬细胞谱系。这些由FCN1^高单核细胞的共同分支过渡为IL1B^高单核细胞，随后是CCL2^高和CCL18^高单核细胞衍生的巨噬细胞。后者随后分支成RGS1^高单核细胞衍生巨噬细胞（RGS1谱系），或通过FABP4^培养基成FABP4^高组织驻留巨噬细胞（肺泡谱系；图 5e）。单核细胞标志物表达沿两个谱系均降低，而巨噬细胞标志物表达升高（图 5f；，图S 3d）），如先前所报道。^{19，31，32个}密度图显示，在COVID-19细胞在两个谱系（图的前半部分中富集 5g），证实在COVID-19单核细胞作者富集上述观察。比较轻度和重症的COVID-19，发现了相似的差异（图 5h）。

沿肺泡谱系建模的基因表达揭示了5个基因集（图 5i；，表 S9）。第1组和第2组的特征是炎性标记（CXCL1-3，CCL20，CXCL8，CXCL10，CCR1，IL1B），存活因子（RAC1，JAK1，ZEB2，CDKN1A），IFN诱导的（抗病毒）基因（IFITM1-3），IFIT1-3，IRF1，MX1 / 2），缺氧（HIF1A）和NF-κB（NFKB1 / 2，NFKBIZ）在谱系中早期发出信号，暗示单核细胞具有高炎症状态。第3组的特征是可能的基于CD47的巨噬细胞抑制表型。第4组的特征在于表达伴侣蛋白编码基因（CALU，CALR，CANX，PDIA4，HSP90B1），这对于MHC分子的抗原加载机制的强大功能至关重要，而在第5组中，有明显的抗原呈递迹象（许多MHC II类基因的表达）。

轻度COVID-19的特征是髓细胞中具有促吞噬功能和促进抗原呈递的功能，而重症COVID-19的特征在于与单核细胞巨噬细胞抑制和ATP嘌呤信号有关的令人担忧的疾病特征-炎症小体，可能使COVID-19相关性纤维化，并可能加重患者的预后。

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图5：COVID-19 BAL中单核细胞向巨噬细胞的分化

6. 定性评估COVID-19中的T细胞和单核细胞/巨噬细胞功能

1. 作者使用REACTOME基因集对每个细胞进行评分，并且在比较COVID-19与非COVID-19 BAL时，作者观察到非COVID-19 T细胞和单核细胞中的IFN信号持续降低（，图S 4a）。
2. 在轻度和重症COVID-19中，作者观察到CD8 ⁺ T _RM-和T _EX中的IFN-（I型和II型），白介素（例如IL12和IL6）和寡聚腺苷酸合成酶（OAS）抗病毒应答信号通路增加了（图 5k；，图S 4b，e）。
3. CD4 ⁺ T _H1同样以轻度COVID-19中的IFN-（I型和II型）和白介素（IL6，IL12，IL21）信号转导为特征（图 5l；，图S 4f，g）。
4. 此外，TRAF6诱导的NF-κB和IRF7激活以及TGFBR复合物激活也增加了。在T _H17谱系中观察到了类似的效果（，图S 4h，i）。
5. 轻度COVID-19中，肺泡巨噬细胞谱系的特征是吞噬作用相关的途径增加（清除受体，脂类毒素或白三烯的合成）和IFN信号传导（图 5m；，图S 4j–m）。
6. 反之亦然，在重症的COVID-19中，IL10信号转导（抑制IFN反应），趋化因子受体结合和ATF4介导的ER应激反应增加。

由于轻度和重症COVID-19富集IFN信号通路，因此作者评估了IFN基因及其受体的特异性表达，以及与抗病毒应答有关的几种重症趋化因子/细胞因子（图S5a）。IFN基因IFNG和IFNE以及IFN受体IFNAR2和IFNGR2在COVID-19和非COVID19中上调，表明IFN信号在增强抗SARS-Cov-2反应中起着至关重要的作用。这也适用于IL6，CCL3和CCL4，以及其他几种IFN反应基因（IFITM1 / 2，MX2，IRF7；图S 5c）。

当比较COVID-19轻症患者与重症患者时，作者发现IFNLR1，IFNA1，CXCL9，CXCL10，IL15和IL15RA在轻症患者中被上调（图S 5b）。在轻度COVID-19患者中，MHC-II表达也显著上调（HLA-DRB5，HLA-DQB2，HLA-DPB1等；图S 5d）。

1. 作者使用一套广泛的嗜中性粒细胞和单核细胞标记基因，以区分从单核细胞14154个嗜中性粒细胞（图：S 6a，b），并比较了这些已公布的scRNA-SEQ的数据集，以确认它们表示可靠嗜中性粒细胞标志物（图S 6c-e）。
2. 中性粒细胞被亚群化为5个表型（图 6a，b；，图S 6f）。
3. 第一簇由基于CXCR4和CD63的“祖细胞”嗜中性粒细胞组成，并且其特征还在于血管生成因子VEGFA的表达和组织蛋白酶（CTSA和CTSD）（图 6c）。
4. 第二个簇由表达LTF，LCN2，MMP8 / 9，PADI4和ARG1的少数“未成熟”嗜中性粒细胞组成。第3组和第4组由“炎症成熟”的中性粒细胞组成，均表达特征性足迹，突出了中性粒细胞的抗病原性：
5. 第3组表达了IFN诱导的基因和钙粒蛋白（S100A8 / 9，S100A9和S100A12），可调节炎症，而第4组则表达高水平的细胞因子（IL1B）和趋化因子（CXCL8，CCL3和CCL4）。
6. 最后一个子集由于其巨噬细胞样特征而被称为“杂交”嗜中性粒细胞，即表达II类MHC和补体激活基因（C1QB，C1QC，CD74），组织蛋白酶（CTSB，CTSL）和APOE。
7. 在COVID-19中，所有中性粒细胞亚群均比非COVID-19更为频繁，但对于“祖细胞”和“炎性成熟”中性粒细胞，注意到最明显的变化（图 6d），对于轻度和重度COVID-19非COVID-19比较，尽管并不总是很明显（图 6e；，图S 6g）
8. 实际上，COVID-19中嗜中性粒细胞的富集与疾病的重症程度，肺损伤和细菌感染（，表S11）以及年龄，性别和潜在疾病无关 。

总体而言，这表明中性粒细胞在COVID-19肺炎中起特定作用，而不仅代表重症肺部炎症的标志。

9. 作者还鉴定了1410个树突状细胞（DC），可以将其亚簇化为6个既定种群（图 6f，g；，图S 6h，i）。在COVID-19和非COVID-19之间，这些均无显著差异，而轻度COV-19与重症COVID-19相比，迁徙DC和朗格汉斯细胞样DC更为频繁（图 6h，i；，图S 6j）。
10. 在1397个B细胞内，作者获得了4个单独的簇（图 6j；，图S 6k）。
11. 滤泡性B细胞由“幼稚”（CD27 ^–）和“记忆”（CD27 ⁺）B细胞组成。前者的特征是独特的CD27 ^– / IGHD ⁺（IgD）/ IGHM ⁺（IgM）基因集，并通过在生发中心迁移形成CD27 ⁺ / IGHD ^–（IgD）/ IGHM ^–（IgM）而产生后者。记忆B细胞（图 6k，1）。
12. 然后，记忆B细胞进一步分化为分泌抗体的浆细胞（IGHA1，IGHG1，JCHAIN），它们本身又可以分为短寿命和长寿命浆细胞。作者未能鉴定长寿命的浆细胞（因为这些是驻留在骨髓和脾脏，非增殖细胞^43，44，但能够短命的浆细胞分成两个亚簇。“活跃”浆细胞的第一子群集表达高水平的PRDM1（Blimp-1）和XBP1，表明具有高抗体分泌能力，而第二个簇称为“终末”浆细胞富集CCL2和CCL5，但其特征还在于G2M和S细胞周期评分降低线粒体基因表达增加，表明持续的压力（图 6m）。
13. 值得注意的是，后一种人群的特征是BCR克隆性增加和BCR均匀性降低（图 6n）。与非COVID-19相比，COVID-19的成熟幼稚B细胞和活性浆细胞增加，而COVID-19的终末浆细胞减少，尽管无统计学意义（图 6o）。
14. 尽管这些影响主要是由重症COVID-19与非COVID-19（，图S 6l）驱动的，但轻度与重症COVID-19（图6p）之间没有显著差异 。

这表明COVID-19中的末端浆细胞的特征是亚最佳的分化或激活，这可能会导致COVID-19中的缺陷或适得其反的抗体反应。

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图6：COVID-19 BAL中的中性粒细胞，树突状细胞和B细胞表型

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8. 上皮细胞和免疫细胞中的SARS-CoV-2病毒颗粒

作者检索到22,215个上皮细胞，类似于Chua等人对其进行了亚群化。

1. 分为7个不同的簇（图 7a，b；，图S 7a–e），最大的3个簇由分泌性，纤毛和鳞状肺上皮细胞组成。稀有的上皮细胞类型，可调节盐平衡（图 7c；，图S 7f）。轻度和重症COVID-19之间无显著差异（图 7d）。
2. 与非COVID-19相比，COVID-19中的ACE2和TMPRSS2表达增加，分别有2.3％和21％的COVID-19上皮细胞表达这些基因（图 7e，f）。
3. 淋巴样和髓样的总数比上皮细胞更高的映射到（图 7g）。RNA编码刺突蛋白（S在细胞病毒进入过程中与ACE2相互作用的）几乎完全在上皮细胞中被检测到，上皮细胞也是唯一表达ACE2和TMPRSS2的细胞（图 7h，i）。
4. 有趣的是，差异基因表达分析显示，S +上皮细胞表现出IFN刺激基因（IFI6 / 27，ISG15 / 20，IFITM1 / 3等；图 7j）和IFN信号通路（图 7k）的表达减少。在髓样细胞和淋巴样细胞中检测到的核衣壳蛋白（N）以及在较小程度上编码ORF10和ORF1a的mRNA的水平要高于上皮细胞（图 7h）。
5. 嗜中性粒细胞和巨噬细胞是最常见的N +细胞类型（图 7l）。N⁺ VS N -的差异基因表达中性粒细胞鉴定出转录因子BCL6的上调，该因子可促进中性粒细胞的存活和病毒感染后的炎症反应，以及许多IFN诱导的基因（IFITM3，IFIT1-3，MX1 / 2，ISG15，RSAD2等；图 7m）。
6. 当比较N⁺ VS N -肺泡和-单源性巨噬细胞，作者注意到参与MHC II类表达，并在一定程度上基因也IFN-诱导的基因（IFIT3，IRF7，MX2，OAS1，OAS3）中过表达，在是不太明显的效果N⁺ VS N -monocytes（图s7g-I ）。
7. 对差异表达基因的途径分析显示，使用REACTOME和使用GO的Response_to_virus对N +-嗜中性粒细胞上调的基因进行IFN信号转导（图 7n，o）。
8. 在不同的嗜中性粒细胞表型中，富集表达钙粒蛋白的“炎症成熟”嗜中性粒细胞（图 7p）。，临界COVID-19与轻度COVID-19中存在明显更多的N（S 7j，k）。

虽然S + -（感染的）上皮细胞减少IFN信号传导，但N + -中性粒细胞的特征是IFN信号传导增加，这表明中性粒细胞是与SARS-CoV-2病毒颗粒相互作用的主要细胞类型，并解释了病毒材料的采购量最高，与其作为感染的先天免疫反应者的作用相符。

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图7：上皮细胞和免疫细胞中的SARS-CoV-2 RNA检测

9. 细胞间通信可揭示COVID-19 BAL的免疫情况

1. 首先，作者计算出的细胞类型（之间的相互作用P ≤0.05）分别为轻度和临界COVID-19，然后作者评估在特定交互的数量差异。
2. 中性粒细胞的特点是特异性相互作用的数量较少，在重症性COVID-19与轻度COVID-19中较常见。
3. 反之亦然，在所有其他免疫细胞和上皮细胞之间，尤其是在轻度COVID-19中，预计会发生许多特异性相互作用（图 8a，b; 图S 8）。
4. 在重症的COVID-19中，单核细胞/巨噬细胞与嗜中性粒细胞之间的特异性相互作用几乎总是涉及促迁移相互作用（FLT1，NRP1或NRP2 / VEGFA，CXCL1或CXCL2或CXCL8 / CXCR2，CCL3或CCL7 / CCR1），并伴有免疫抑制作用交互，如LILRB1或LILRB2 / HLA-F和RPS19 / C5AR1，这也诱导嗜中性粒细胞功能障碍（图 8C）。
5. 一些刺激性T细胞与嗜中性粒细胞的相互作用，包括IFNG / II型IFNR，PDCD1 / CD274，LTA / TNFRSF1A或TNFRSF1B（图 8d），而特定的上皮细胞与嗜中性粒细胞的相互作用仅限于髓系混合物免疫抑制（RPS19 / C5AR1）和病毒感染相关的促炎信号（TNFRSF14 / TNFSF14）（图 8E）。
6. 在T细胞和单核细胞/巨噬细胞中，发现了一些免疫刺激或自动调节相互作用（CTLA4或CD28 / CD80或CD86，CCL5 / CCR5）（图 8f），但重症COVID-19中T细胞的特异性上皮相互作用仅限于促炎性ICAM1介导的相互作用（图 8g）。
7. 在轻度COVID-19中观察到了非常不同的情况（图 8c-g）。在单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞之间的众多相互作用中，作者注意到白介素信号传导（双向IL1B，IL1A，IL1RN / A信号传导，IL7 / IL7R，CXCR2 / CXCL1或CXCL8），还有MRC1 / PTPT（吞噬作用）和LTBR / LTB（促炎）。
8. T细胞和中性粒细胞之间的特异性相互作用涉及CCR1 / CCL3或CCL3L1（促炎症），CD2/ CD58（共刺激/免疫原性途径）和CD94：NKG2E / HLA-F（抗病毒免疫监视），而在上皮细胞和嗜中性粒细胞之间，IL1R / IL1A或IL1B或IL1R相互作用最为明显（可促进生产性嗜中性白细胞免疫在免疫控制/免疫原性的背景下）。
9. 相互作用也上皮细胞和单核细胞/巨噬细胞之间观察GAS6或PROS1 / AXL（受体介导的吞噬作用），ADORA2B / ENTPD1（细胞外ATP降解/抑制），CD83 / PECAM1（免疫激活）和信号量与它们的plexin和NRP受体相互作用（组织重塑和修复）。
10. 在上皮细胞和T细胞之间，作者观察到主要是共刺激（CD46 / JAG1，CD40LG / CD40，IL7R / IL7，MICA或RAET11 / NKG2D受体）和组织修复相互作用（TGFB1 / TGFR2和TGFB1 / TGFBR3）。
11. T细胞和单核细胞/巨噬细胞，还有其他共同刺激（LTA / TNFRSF1A或TNFRSF1B或TNFRSF14，TNFSF10 / TNFRSF10B）或组织修复因子（CSF1 / CSFR1，TGFBR3 / TGFB1，IL15RA / IL15），T细胞稳态和细胞毒性（的介质FASLG / FAS）和抗病毒免疫监视（NKG2D II受体/ MICB或MICA）。

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图8：上皮细胞与免疫细胞之间的细胞间通讯