大家好，本周给大家分享的是一篇2021年11月5日发表在Nature Communications上关于NLR基因赋予大豆疫霉病菌广谱抗性的一篇文章。
文章题目：A giant NLR gene confers broad-spectrum resistance to Phytophthora sojae in soybean (NLR基因赋予大豆疫霉病菌的广谱抗性)
期刊： Nature Communications
影响因子：2020_IF = 14.919; 中科大类: 综合性期刊 1区; 中科小类: 综合性期刊 1区; JCR分区: Q1
发文单位：美国普渡大学农学系，Corteva Agriscience研发部等5家单位。
文章作者：普渡大学Weidong Wang 为第一作者，Jianxin Ma 为通讯作者。
摘要：大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉引起的一种破坏性的大豆土传病害。鉴定对该病原体具有广谱抗性的基因对于防止疾病爆发很有必要。作者发现大豆Rps11是一个27.7kb核苷酸结合位点富含亮氨酸重复序列（NBS-LRR或NLR）基因，对该病原体具有广谱抗性。Rps11所在基因组区域包含一个单一来源的大豆大的NLR基因簇，来源于多轮不等重组。这些事件导致的启动子融合和LRR扩增可能有助于广谱耐药。在系统发育树上具有代表性的品种之间的NLR基因簇表现出剧烈的结构多样性，包括基因拷贝数变异，在所检测到的非Rps11供体品种中出现Rps11的等位基因拷贝缺失。
主要结果：
1、Rps11精细比对和Rps11候选基因的鉴定
作者注释并比较了Rps11区域，该区域包含来自PI 594527基因组的整个NLR簇，以及来自Williams 82基因组（v3.0）的相应区域。来自PI 594527的~648 kb Rps11区域由12个NLR基因组成（称为R1–R12）（图1a）。来自Williams 82 （v.3.0）的~522 kb对应区域由8个NLR基因（称为r1–r8）组成。在这些基因中，R8-r7似乎是两个基因组之间唯一的等位基因对（图1a）。PI 594527和Williams 82之间只有一小部分区域作为共线区域，这些区域能够设计用于精细比对的标记（图1a）。同时结合来自43个重组个体的基因型和表型数据，最终将Rps11位点定义为PI 594527的151 kb区域，包含四个NLR基因（R5、R6、R7和R8）（图1b）。通过检测Rps11候选基因的表达发现，所有检测到R6表达的重组个体都对疫霉病菌小种1耐药，而所有未检测到R6表达的重组个体都对小种1敏感（图1c），这些结果表明R6确实是Rps11的候选基因，R6也在其他组织中表达(图1d)。由5′-RACE确定Rps11产生起始密码子和终止密码子的“ATG”和“TAG”之间的基因组区域为14.1kb，其转录起始区（TSR）位于“ATG”上游13.1kb，其转录终止位点（TTS）位于TAG”下游0.5 kb（图1e），基因DNA总长为27.7 kb（图1f），同时发现尽管Rps11拥有一个从“TSR”到“ATG”的非常长的区域，但该区域携带三个大内含子和一个小内含子（图1f），并且主要转录到mRNA的560bp 5′-非翻译区（5′-UTR）Rps11拥有一个从“TSR”到“ATG”的非常长的区域，但该区域携带三个大内含子和一个小内含子（图1f），并且主要转录到mRNA的560bp 5′-非翻译区（5′-UTR）。
图1. Rps11基因座的图位克隆。a.Williams 82（V3.0）和PI 594527之间NLR基因簇的比较。黑框代表NLR基因，浅蓝色阴影代表两个基因组之间的共线块。b.用于Rps11基因座精细定位的标记的物理位置。c.通过RNA-seq分析关键重组个体中NLR基因的表达。绿色/浅绿色框代表来自PI 594527的五个表达NLR基因，黑色框代表来自PI 594527的非表达NLR基因。灰色框代表来自Williams 82的NLR基因。虚线表示未知的基因型。每个关键重组个体的表型在每个重组体类型的右侧，显示为抗性或易感。d.不同组织中R6的相对表达。e. 对5个表达的NLR基因（R1、R4、R6、R9和R12）进行5′-RACE，以确定转录状态区（TSR）。x轴表示第一外显子上游的距离。棕色条表示映射到每个NLR基因的5′RACE读长。橙色线条/阴影显示启动子区域共享序列相似性。右侧的箭头指示NLR基因的方向。f. Rps11（R6）的基因模型。
2、Rps11赋予大豆疫霉抗性
为了进一步证明Rps11的功能，作者建立Rps11转基因株系并检测其对病原体的响应。作者使用拟南芥泛素基因AtUbi3（pAtUbi3）的启动子来驱动Rps11 CDS（CDS-Rps11）的表达，将pAtUbi3:：CDS-Rps11载体转入大豆优良品种93Y21中，该品种对大豆疫霉小种25、31和OH12108-06-03敏感。发现带有转基因的T2后代对这三个疫霉小种表现出的抗性水平与来自纯合F5 RIL（Rps11/Rps11）群体所显示的水平相似（图2a，b），非转基因93Y21（对照）对这些疫霉小种敏感（图2a，b）。在这些T2后代中可以检测到R6的表达，同时发现在F5 RIL中，R6的表达水平低于RIL株系中的表达水平（图2c）。因此，R6在这些转基因系中没有“过度表达”。 鉴于Rps11也在PI 594527的其他组织中高度表达（图1d），转基因Rps11显示的抗性反映了天然Rps11基因的功能。
图2. 互补试验结果。a.两个独立的转基因株系的抗性照片。在每个转基因事件中，三个纯合T2代、一个非转基因系（对照）和一个F5 RIL（Rps11/Rps11）分别进行疫霉接种。b. 与非转基因品系和使用Race 25的F5 RIL相比，纯合T2家系的抗性试验统计。c. 在两个转基因株系、非转基因株系（对照）和F5 RIL中， R6的相对表达比较。
3、Rps11基因座中NLR基因的进化史
与典型的NLR基因相比，PI 594527中的大型NLR基因主要通过LRR结构域的串联重复而扩大（图3a）。为了了解这些大型NLR基因的起源和进化历史，作者利用这些基因中结构更为保守的NB-ARC结构域构建了一个系统发育树，显示了PI 594527中所有512个NLR基因的关系。作者发现，这些大NLR基因在系统发育树上被分为一个分支（图3b），并共享类似的结构，这表明它们来源相同。点图和系统发育分析表明，约1300万年前第二次WGD事件发生后，通过多轮串联重复事件，每次串联重复涉及一个或两个相邻的NLR基因，最终形成Rps11区域的12个NLR基因，这些基因可能来源于单拷贝R5（图3c–e）。
图3. Rps11基因座中NLR基因的进化史。a. 大型NLR基因和经典NLR基因之间蛋白质序列的比较。线代表两个蛋白质序列之间的比对。橙色突出显示NB-ARC域区域。浅蓝色突出显示LRR域区域。b. 利用PI 594527中所有NLR基因保守的NB-ARC结构域区域构建系统发育树。大型的NLR基因和典型大小的NLR基因被标记。c. PI 594527中Rps11区域内序列比较的点图。浅绿色突出显示R1–R2、R3–R4和R11–R12的片段重复（重复1、D1）。浅橙色突出显示R7、R8和R10的分段复制（重复2、D2）。d. Rps11下所有NLR基因与NLR基因Chr16.R1的系统发育关系，该基因来自其全基因组复制区，使用转录序列构建。e. Rps11区域巨大NLR基因簇的进化史说明。绿色框表示NLR基因，黑色框表示预测的非NLR基因。
4、大豆泛基因组中缺失等位基因拷贝
作者从构建泛基因组的28份大豆材料的高质量基因组中注释了基因组区域中总共296个NLR基因，它们对应于~648 kb Rps11区域。在这些品种中观察到有趣的NLR基因的拷贝数变异，从5到23个拷贝不等（图4），这种变异主要是由不同NLR基因之间的不平等重组引起的，导致片段重复、缺失和倒位。这种变异似乎与Rps11区域内单核苷酸多态性（SNP）数据所揭示的材料间的系统发育关系有关（图4）。W05中两个相邻NLR基因预测的CDS上游的基因组序列与Rps11的TSR到“ATG”的13.1kb的区域相匹配，表明Rps11的13.1kb区域是在与W05分离后，通过PI 594527中这两个相应的基因组序列的融合形成的（图4）。另外，保守TSR的存在/缺失可能是不同大豆基因组中Rps11区域和“rps11”区域（缺少Rps11的等位非功能拷贝）的NLR基因表达剧烈变化的原因（图4）。
图4. NLR基因簇在30个不同大豆基因组中的多样性。左侧的系统发育树是使用Rps11区域的SNP数据构建的。橙色突出显示了四个主要的单倍型组。每个黑框代表一个NLR基因。灰色阴影表示基因组间的共线块。浅蓝色突出显示倒位事件。绿色高亮显示串联重复事件。浅红色突出显示潜在的不等重组事件。
总之作者利用精细定位和图位克隆在大豆中分离出对大豆疫霉具有广谱抗性的Rps11，并证明了NLR基因簇的起源和进化动力学。。
文中所有图片均来自A giant NLR gene confers broad-spectrum resistance to Phytophthora sojae in soybean
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文章链接地址：https://www.nature.com/articles/s41467-021-26554-8
参考文献：
Wang, W., Chen, L., Fengler, K. et al. A giant NLR gene confers broad-spectrum resistance to Phytophthora sojae in soybean. Nat Commun 12, 6263 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-26554-8