ceRNA证据与争议

ceRNA（competitive endogenous RNA，竞争性内源RNA）假说是哈佛医学院Pier Paolo Pandolfi研究小组在2011年提出的，它是一种基因表达调控模式，共享miRNA结合位点的转录本会竞争结合相同的miRNA，由此调控彼此的表达水平。ceRNA的机制，一是当ceRNA表达沉默时，mRNA被转录并输出到细胞质中，在那里它被miRNA介导沉默复合物(miRNA-RISC)靶向，导致加速降解、阻断翻译和降低表达；二是当ceRNA表达激活后，它就会竞争miRNA的靶向性和与RISC复合物的结合，降低miRNA抑制功能。miRNA-RISC复合物与基因隔离，导致基因表达增加。ceRNA假说认为，内源性RNA分子具有miRNA作用位点，可以竞争性的与miRNA结合，从而间接调控miRNA靶基因的表达，这种竞争性结合miRNA的作用又被叫做miRNA海绵作用（microRNA sponges）。

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ceRNA假说自提出以来，就引起了科研研究者的广泛注意。ceRNA 假说的提出赋予了mRNA和非编码RNA更为广泛的生物学意义，通过RNA-RNA的调控网络在生理病理过程中发挥作用，如它有潜力解释数千种尚未鉴定的lncRNA的大部分功能。虽然已经有大量的研究结果为ceRNA假说提供了相关支持，但是也存在相关的质疑。Nature Reviews Genetics发表的文章Endogenous microRNA sponges: evidence and controversy，分六个部分评估了支持和反对ceRNA假说的一些证据和内源性miRNA海绵（miRNA sponge）互相作用的影响。相关概念
1、microRNAs(miRNAs) 是小的非编码RNA（长20-22个核苷酸），通过引导RNA诱导的沉默复合体（RISC）靶向靶基因来抑制基因表达，是基因表达的重要调节剂。miRNA通过指导RISC靶向mRNA来控制基因表达，从而引起RNA降解或翻译抑制。在蛋白质组学，转录组学和AGO免疫沉淀研究的支持下，miRNA能够靶向数百种基因，这使其具有调控至少三分之二的真核转录组的潜力。
2、long non-coding RNAs(lncRNAs) 长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA，很少或没有蛋白质编码潜能的转录物。根据长度从而将它们与mRNA和小型非编码RNA（例如miRNA，snoRNAs和tRNAs）区分开来。lncRNA作用机制如：A) 作为顺式/反式作用因子调控gene表达；B) 通过改变染色体重塑和组蛋白修饰，调控基因表达；C) 调控选择性剪切；D) 生成小的双链内源性干扰RNA，如siRNA；E) 调控蛋白活性；F) 作为大分子复合物或细胞组分支架RNA或组成部分；G) 改变蛋白定位；H) 生成小单链ncRNA，如miRNA。
3、circular RNAs(circRNAs)主要由自可变剪接的非规范形式产生，即一个外显子的剪接供体位点与上游外显子的剪接受体位点连接。尽管circRNA是由外显子序列构成，但是一般并不翻译成蛋白。circRNA呈封闭环状结构比线性转录本对核酸外切酶的抵抗力更高，因此更稳定，这被认为比线性转录本能够更有效地抑制miRNA活性。
4、pseudogene是通过与其亲本基因的DNA同源性鉴定，但具有进化获得的突变。假基因是基因的简并拷贝，主要通过DNA复制（重复的假基因）和细胞RNA的逆转座（加工的假基因）合成。
5、antisense RNA是指与mRNA互补后，能抑制与疾病发生直接相关基因的表达的RNA。它封闭基因表达，具有特异性强、操作简单的特点，可用来治疗由基因突变或过度表达导致的疾病和严重感染性疾病。
6、competitive endogenous RNA(ceRNA) ，是miRNA靶向的转录物，它不是某一种RNA分子，其可以包括mRNA、假基因转录物、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA）等。在这种情况下，它可以隔离结合的miRNA的活性，从而有效地抑制该miRNA的其他靶标，通过竞争microRNA结合位点导致靶基因表达上调的RNA。
7、ceRNA network通过竞争相同的单个miRNA或miRNA集合，协同隔离miRNA活性的转录本的相互作用的网络。通常包含四种RNA（mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA），其中mRNA的数量占大多数，而miRNA处于调控的核心地位，当miRNA被lncRNA或circRNA这类ceRNA竞争结合时，受miRNA调控的mRNA转录水平会上升。
Part1：人工miRNA抑制剂
目前最常用的miRNA抑制工具是反义寡核苷酸（Anti-miR， Antagomir）和miRNA海绵（miRNA sponge）。通过引入反义寡核苷酸或通过过表达含有miRNA结合位点的转基因载体来抑制miRNA。现在反义RNA作为miRNA抑制剂在分子研究中是常规的，并且已经将其用作一类新型药物取得了进展。
寡核苷酸miRNA抑制剂通常由小单链RNA寡核苷酸组成，与miRNA几乎完全互补。对寡核苷酸进行修饰以改善其稳定性，从而提高其功效。其修饰包括2′-O-甲基化，胆固醇修饰或形成一个发夹结构，以增强其稳定性。它们通过转染或在体内通过病毒转导进入细胞。此外，纳米颗粒载体已被开发用于组织特异性递送作为治疗。
miRNA海绵是人为构建的表达3′UTRs，包含多个miRNA结合位点的载体，在强启动子的作用下进行稳定表达，竞争性的结合目的miRNA，从而将靶mRNA去抑制。与反义寡核苷酸相比，这种miRNA海绵的优势在于，它有可能被U6或巨细胞病毒(CMV)等启动子驱动，从而实现可调控的、稳定的表达，而这些启动子是哺乳动物系统中最强的表达驱动因子之一。
人工反义RNA作为miRNA抑制剂的广泛应用，证明了RNA竞争的基本生化原理。然而，它们的应用并不局限于生理表达水平，因为通常用于miRNA敲除实验的浓度远远超过了高表达的miRNA的总细胞浓度。使用反义miRNA抑制剂的研究表明了高抑制剂浓度对有效沉默miRNA的必要性。无论采用何种方法，引入的人工miRNA抑制剂的疗效都取决于其在细胞中的浓度，而浓度的高低又直接受到抑制剂稳定性的影响。然而，由于转染后的寡核苷酸在溶酶体等非功能囊泡中积累，因此很难测量其功能量，从而在整个细胞裂解后人为地提供了高定量。尽管达到了非生理学的高水平，人工miRNA海绵只能部分抑制，通常对高表达的miRNA的抑制不超过50%。Part2：ceRNAs的实验证据
ceRNA假说的一个吸引人的方面是，它提供了一种通过识别的假定的miRNA结合位点来预测任何RNA转录本非编码功能的途径。ceRNAs的实验在最基本的层面上，识别ceRNA相互作用可假定的ceRNA过表达导致竞争对手的表达增加，或观察当ceRNA被抑制时的相互关系，可以采用qRT-PCR或western blot测量基因表达。进一步为了证明表达的变化是miRNA竞争的直接结果，可以进行同时敲除特定的miRNA和/或小RNA生物合成所需的细胞成分的实验的实验。用于识别和验证ceRNA相互作用的其他实验策略在很大程度上模拟了用于识别miRNA靶标的策略。这些方法包括在体内或体外干扰miRNA水平，然后进行基因表达分析，以评估竞争性靶基因的协同下调。
目前已由实验证据支持的ceRNA主要有以下几种：
1、假基因作为ceRNA：由于假基因的起源是基因拷贝，所以它们与它们的同源基因具有高度的序列同源性。因此，一个表达的假基因将共享miRNA的靶位，这些靶位可以竞争miRNA的结合，如PTENP1、OCT4P4等。但这些观察结果推广到所有其他转录的假基因几乎没有依据的。同样假基因的稳态表达水平很少达到其亲本基因的表达水平，大多数个体的伪基因表达过低，不能作为可行的竞争目标，但原则上可以累积表达序列非常相似的假基因，以达到足够的靶位点丰度，充当ceRNAs。
2、circRNA作为ceRNA：circRNA因为它们没有易被外切酶消化的游离端从而比线性转录本稳定得多，这是一种特性，被认为有助于它们作为miRNA海绵的有效性，如实验证实cIRS‑7(CDR1‑AS)在中枢神经系统中调控miR-7的活性。
3、mRNA作为ceRNA：PTEN的研究等研究结果观察到3′UTR的单独表达能够引起ceRNA效应，这表明编码转录本具有非编码功能，也可通过ceRNA机制来调节靶基因的表达量。这些数据进一步证明，来自同一位点的转录本可以通过独立的机制发挥多种功能，包括蛋白编码和非编码功能。
4、病毒microRNA海绵：已知病毒利用各种不同的机制来操纵宿主基因的表达，尤其是使用非编码RNA的机制。现在有越来越多的证据表明，病毒会产生作为miRNA海绵的非编码RNA，这为ceRNA机制提供了有趣的适应性，可以解释ceRNA活性的增加，如两种病毒snRNAs均下调宿主miRNA的报道首次揭示了病毒通过miRNA海绵机制控制宿主表型的潜力。

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Part3：ceRNA网络
1、转录组广泛的RNA竞争结合miRNA的证据。
大多数实验验证ceRNA相互作用的证据都是针对ceRNA - target对评估一个或几个miRNAs。由于实验的局限性，直接的ceRNA相互作用的演示通常局限于单个基因。但通过蛋白质组学、转录组学和AGO免疫沉淀研究表明，单个的miRNA能够靶向数百个基因。
2、 ceRNA相互作用的生物信息学预测
一个广泛影响转录组的巨大ceRNA网络的潜力也开始被推测，尤其是通过使用先前开发的用于预测miRNA靶标的生物信息学工具预测ceRNA相互作用。目前使用最广泛的miRNA靶标发现算法是在miRNA的5 ''端即种子区和靶mRNA的3 '' UTR之间寻找进化保守的6个核苷酸的相互作用。利用miRNA靶标发现算法，如TargetScan和miRanda，一些研究开发了ceRNA相互作用的数据库，如ceRDB，lnCeDB，Linc2GO，miRcode， DIANA-LncBase Predicted，LncACTdb等。
3、利用基因表达数据建立ceRNA网络模型
原则上，可以通过列出所有miRNA-target对，并评估同一miRNA靶向的mRNA在表达上的相关性是否更显著来评估ceRNAs对基因的调控程度。miRNA靶标预测与基因表达数据库的比较表明，miRNA和预先确定的靶标更可能具有负相关的基因表达，这与miRNA –靶基因对的预期一致。

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Part4：转录组广泛的RNA竞争
1、内源性基因全转录组RNA大量存在可以降低miRNA活性。通过比较转录组靶丰度预测和miRNA活性高通量分析，可以观察到大量内源性靶点对miRNA活性的抑制作用。还注意到miRNA活性与miRNA丰度之间的相关性较弱。

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2、靶点越多，过表达的miRNA活性越低。测量大量内源性靶点的抑制作用的另一种方法是将预测的靶点丰度与miRNA过度表达后的靶点抑制进行比较。预测到更多的靶标转录物时，miRNA的效力可以被降低。

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3、生理上ceRNA的表达变化并不影响高表达的miRNA。只有当miRNA-target的摩尔比例达到一致时，ceRNA才能达到最好的抑制效果。
4、大多数个体靶点的丰度不足以改变活性的miRNA。这些实验支持了miRNA-target比值决定了靶抑制对靶竞争的敏感性的假设。除了目标池异常小且ceRNA具有高亲和力的极端情况外，大多数活性miRNA的高丰度不太可能受到ceRNA竞争的影响。

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Part5：增强ceRNA活性的模型
化学计量的ceRNA相互作用模型与实验报道的单个ceRNA的数量之间存在明显的脱节。虽然评估转录组范围目标丰度的模型表明，单个转录本在生理上无法达到引发竞争所需的丰度，但得到实验证据支持的报告正在增多。这受益于分子模型，可以更好地描述ceRNA活性如何能被增强，而不仅仅是丰度的函数。转录组范围的化学计量学模型通常依赖于错误的假设，即细胞类似于水溶液。一个相关的论点解释了低丰度转录本和功能之间的不一致，即区域化或亚细胞定位将增加活动部位的RNA浓度。这一观点相关文章中得到了重申，推测将miRNA捕获在P-bodies或miRNA介导的RNA衰变的其他位点会增强ceRNA的调节。这一概念坚持认为lncRNA可以表现出高度特异性的定位和表达模式。然而，这提出了一个问题: 发生ceRNA活性的亚细胞位置是什么?AGO免疫沉淀技术的应用非常适合于识别活性ceRNAs的特定亚细胞定位。通过亚细胞定位来丰富表达的潜力仍然是增强ceRNA功能的一个论据。可以合理地推测，ceRNA活动的共分化仍有可能独立于RISC复合体而发生。我们也经常观察到lncRNA表达可以受到高度的时间调控，导致其表达协调一致性，这提示我们lncRNA表达协调可能通过高度调控miRNA及其竞争靶点的共表达来增强ceRNA活性。
另一个影响ceRNA活性的因素是ceRNA的稳定性，它被认为是设计人工寡核苷酸miRNA抑制剂时的一个重要考虑因素。内源性转录本的稳定性是高度可变的，因为内源性转录本的结构成分具有更大的稳定性，如发夹二级结构或circRNA，对外切酶的敏感性要低得多。同样，miRNA结合位点的结构背景，例如由3′UTR亚型提供的结构背景，被认为是影响miRNA结合的因素。这是通过观察得到的支持，当靶区不稳定时，如AGO2切割的完美互补靶区，miRNA被隔离的可能性更小。不完全碱基配对已被证明可以增加miRNA的结合，其时间是完全互补靶点的20倍。
最近还有几种分子途径被描述，它们解释了ceRNA机制的微妙调控是如何通过下游过程被放大的。例如，miRNA与低表达lncRNA竞争导致转录因子适度上调可能通过向多效靶点发送信号放大了下游后果，这一概念被称为通路分歧。另一个有希望增强ceRNA活性的机制是HCV RNA。HCV RNA除了具有有效隔离高度丰富的miR-122的结合位点外，miR-122还稳定了HCV RNA，构成一个正反馈环，有效地增强了其ceRNA活性。Part6：ceRNA验证的局限性
转录组范围的建模数据和实验验证之间的差异是每种方法特有的局限性的结果。
在此，我们总结了用于研究ceRNA机制的实验和生物信息学方法的显著局限性。针对ceRNA相互作用的实验证据的许多局限性包括过表达系统缺乏生理相关性。随着miRNA模拟物的引入，很难复制生理miRNA的表达，尤其是当转染的寡核苷酸在溶酶体中被收集而不能引起miRNA活性时，很难直接测量引入的miRNA的活性。免疫沉淀技术能够定量测定miRNA和靶基因的内源性表达，用AGO免疫沉淀技术对内源性miRNA和其靶基因进行定量时，过表达的外源性AGO也可影响内源性的RISC活性。此外，dicer敲除的细胞系已被广泛用于证明分子或细胞机制对miRNA的依赖。Dicer在miRNA生物发生中的作用已被广泛认识，但 Dicer的多效性效应也被观察到，由于基因敲除或siRNA诱导的沉默不能被专门设计成两种功能，因此很难通过单独抑制功能来区分mRNA的编码和非编码功能。
评估ceRNA活动的研究，尤其是数学建模研究的一个潜在的和压倒性的局限性是，它们完全依赖于miRNA–target预测算法的应用。miRNA预测算法的局限性和不足得到了广泛的认识，如：TargetScan仅通过编码转录物的3′UTR来预测miRNA的靶基因；PITA、miRanda和TargetProfiler仅考虑了miRNA-target相互作用的可能性。总结
ceRNA假设机制被证明是一把双刃剑，尽管它可以提供一种机制来解释任何RNA的功能，但它也必须在整个转录组的背景下进行仔细的研究。了解RNA-RNA竞争如何在所有细胞转录本中发生，需要应用转录组水平的方法来了解miRNA海绵在生理限制下的功能。此外，了解miRNA和ceRNA的化学计量是至关重要的，因为miRNA的效力是由其细胞丰度决定的，或者更准确地说，是由其在RISC复合物中的丰度决定的。这意味着，对于更活跃的miRNAs，所需的竞争性转录本数量要高得多。研究ceRNA相互作用的实验操作的局限性需要更严格的评估。许多研究使用miRNA过表达来研究ceRNA相互作用，使用转染的寡核苷酸抑制剂或表达载体。由于这些实验通常是在生理表达领域之外，它们高估了ceRNA的潜在活动。综合考虑相关证据发现，ceRNA假说在miRNA与miRNA靶标之间的竞争潜力方面具有深远的影响，并且在解释与异常转录组改变相关的病理方面显示出最大的效用，如3′UTRs的广泛重构以及癌症中观察到的聚腺苷酸化动力学。