【基因组学工具】变异注释SnpEff

写在前面
在进行基因组学研究中，总避免不了对一些SNP和Indel进行分析，如何去注释它们的，就需要用到SnpEff，SnpEff是一个变异注释和预测变异影响(氨基酸和核酸改变)的工具。

1.介绍

安装

因为是用JAVA编写的，所以需要提前安装JAVA。

http://snpeff.sourceforge.net/download.html

概括介绍

Input:通常是VCF(variant call format)文件，也接受BED文件(如来自ChIP-Seq peaker)

Output:注释变异并预测对已知基因的影响。

内置数据库包含超过2500个基因组，包括大多数哺乳动物，植物，细菌和真菌基因组。

变异类型

Type	What is means	Example
SNP	Single-Nucleotide Polymorphism	Reference = 'A', Sample = 'C'
Ins	Insertion	Reference = 'A', Sample = 'AGT'
Del	Deletion	Reference = 'AC', Sample = 'C'
MNP	Multiple-nucleotide polymorphism	Reference = 'ATA', Sample = 'GTC'
MIXED	Multiple-nucleotide and an InDel	Reference = 'ATA', Sample = 'GTCAGT'

数据库

从4.0版本开始，SnpEff自动下载和安装所有数据库。

查看支持的数据库。

 $ java -jar snpEff.jar databases | less

寻找特定的数据库。

$ java -jar snpEff.jar databases | grep -i musculus
GRCm38.68                                                    Mus_musculus                                                 OK         http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
GRCm38.69                                                    Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
GRCm38.70                                                    Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
GRCm38.71                                                    Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
GRCm38.72                                                    Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
GRCm38.73                                                    Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
GRCm38.74                                                    Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
NCBIM37.64                                                   Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
NCBIM37.65                                                   Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip
NCBIM37.66                                                   Mus_musculus                                                               http://sourceforge.net/projects/snpeff/files/databases/v3.4/snpEff_v3.4_Mus_musculus.zip

2.启动 SnpEff

基本例子：使用SnpEff进行注释

以系统提供的vcf样本为例。examples/test.chr22.vcf

$ java -Xmx4g -jar snpEff.jar GRCh37.75 examples/test.chr22.vcf > test.chr22.ann.vcf #-Xmx4g指定使用4g内存，
​
# Here is how the output looks like
$ head examples/test.chr22.ann.vcf 
##SnpEffVersion="4.1 (build 2015-01-07), by Pablo Cingolani"
##SnpEffCmd="SnpEff  GRCh37.75 examples/test.chr22.vcf "
##INFO=
##INFO=
##INFO=
#CHROM  POS  ID  REF  ALT  QUAL  FILTER  INFO
22  17071756  .  T  C  .  .  ANN=C|3_prime_UTR_variant|MODIFIER|CCT8L2|ENSG00000198445|transcript|ENST00000359963|protein_coding|1/1|c.*11A>G|||||11|,C|downstream_gene_variant|MODIFIER|FABP5P11|ENSG00000240122|transcript|ENST00000430910|processed_pseudogene||n.*397A>G|||||4223|
22  17072035  .  C  T  .  .  ANN=T|missense_variant|MODERATE|CCT8L2|ENSG00000198445|transcript|ENST00000359963|protein_coding|1/1|c.1406G>A|p.Gly469Glu|1666/2034|1406/1674|469/557||,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|FABP5P11|ENSG00000240122|transcript|ENST00000430910|processed_pseudogene||n.*397G>A|||||3944|
22  17072258  .  C  A  .  .  ANN=A|missense_variant|MODERATE|CCT8L2|ENSG00000198445|transcript|ENST00000359963|protein_coding|1/1|c.1183G>T|p.Gly395Cys|1443/2034|1183/1674|395/557||,A|downstream_gene_variant|MODIFIER|FABP5P11|ENSG00000240122|transcript|ENST00000430910|processed_pseudogene||n.*397G>T|||||3721|
22  17072674  .  G  A  .  .  ANN=A|missense_variant|MODERATE|CCT8L2|ENSG00000198445|transcript|ENST00000359963|protein_coding|1/1|c.767C>T|p.Pro256Leu|1027/2034|767/1674|256/557||,A|downstream_gene_variant|MODIFIER|FABP5P11|ENSG00000240122|transcript|ENST00000430910|processed_pseudogene||n.*397C>T|||||3305|

第八列ANN是SnpEff添加的注释信息，老版本的会使用EFF。

添加-v(verbose)参数显示详细的分析过程，便于纠正报错。可以看到第一次指定数据库也是下载安装基因组的过程，第二次就会直接调用本地版本。

输出结果会生成一个html文件，会显示基本的统计信息和对变异的分析。

3.命令和命令行参数

运行加速：

一是不做统计。如果vcf文件中没有成百上千个样本的话，应该使用-noStats来提高运行速度。

二是使用多线程。参数-t来实现。

过滤

对输出结果进行过滤。

使用SnpSift filter实现输出结果的过滤。

Command line option	Meaning
-no-downstream	Do not show DOWNSTREAM changes
-no-intergenic	Do not show INTERGENIC changes
-no-intron	Do not show INTRON changes
-no-upstream	Do not show UPSTREAM changes
-no-utr	Do not show 5_PRIME_UTR or 3_PRIME_UTR changes
-no EffectType	Do not show 'EffectType' (it can be used several times) e.g: -no INTERGENIC -no SPLICE_SITE_REGION

经典转录本

一个基因中经典的转录本被定义为蛋白编码转录本中最长的CDS，如果一个基因中没有一个转录本是蛋白编码的，那么它就是最长的cDNA。使用-canon来调用经典转录本功能。

4.输入和输出文件

介绍vcf文件

vcf文件是tab分隔的，通常包含以下八个内容。Chromosome name，Position，Variant's ID，Reference genome，Alternative (i.e. variant)，Quality score，Filter (whether or not the variant passed quality filters)，INFO : Generic information about this variant. SnpEff adds annotation information in this column.

示例：

#CHROM POS     ID        REF    ALT     QUAL FILTER INFO                    
20     14370   rs6054257 G      A       29   PASS   NS=3;DP=14;AF=0.5;DB;H2
20     17330   .         T      A       3    q10    NS=3;DP=11;AF=0.017 

vcf的输出

vcf也是默认的标准输出。

vcf输出文件的ANN区域

示例：

ANN=T|missense_variant|MODERATE|CCT8L2|ENSG00000198445|transcript|ENST00000359963|protein_coding|1/1|c.1406G>A|p.Gly469Glu|1666/2034|1406/1674|469/557||,T|downstream_gene_variant|MODIFIER|FABP5P11|ENSG00000240122|transcript|ENST00000430910|processed_pseudogene||n.*397G>A|||||3944|

一个变异通常由超过一个注释，多个注释用逗号来分隔，每个注释的子区域都用|来分隔。

Annotation      : T|missense_variant|MODERATE|CCT8L2|ENSG00000198445|transcript|ENST00000359963|protein_coding|1/1|c.1406G>A|p.Gly469Glu|1666/2034|1406/1674|469/557|  |
SubField number : 1|       2        |    3   |  4   |       5       |    6     |      7        |      8       | 9 |    10   |    11     |   12    |   13    |   14  |15| 16

对注释的子区域进行解读：

1.Allele(or ALT)：变异位点

2.Annotation (a.k.a. effect):使用序列本体术语来注释影响。

3.Putative_impact: 对基本影响的简单估计(HIGH, MODERATE, LOW, MODIFIER)

4.Gene Names:常用的基因名(HGNC)

5.Gene ID

6.Feature type:哪种类型的特征， (e.g. transcript, motif, miRNA, etc.)。

7.Feature ID:可能是Transcript ID (preferably using version number), Motif ID, miRNA, ChipSeq peak, Histone mark, etc。

8.Transcript biotype:“Coding”, “Noncoding”

9.Rank / total:外显子或内含子等级/总的外显子或内含子数量。

10.HGVS.c:使用HGVS符号的变异。

11.HGVS.p:

12.cDNA_position / cDNA_len:在cDNA或转录本cDNA的位置。

13.CDS_position / CDS_len:

14.Protein_position / Protein_len:

15.Distance to feature:可以是空的。

16.Errors, Warnings or Information messages: 影响注释准确性的错误，警告或提示信息。

每个vcf行的多条注释：

出现多条注释的原因：

1.一个变异影响多个基因，如一个变异可以是一个基因的下游或者另一个基因的上游。

2.基因有多个转录本，单个变异影响每个转录本。

5.癌症样本

6.添加注释

SnpEff也能对非编码区和调节区域进行注释。

只对少数几个物种有效(如人，鼠等)

进行该注释前，首先该看看自己研究的这个物种有没有调节性的数据库。

7.输出总结文件

参考链接
http://snpeff.sourceforge.net/SnpEff_manual.html