本文选自gastroenterology，https://doi.org/10.1053/j.gastro.2019.05.004，喜欢的朋友可以自行下载阅读。
二话不说，先上图。
这个HIF有必要捯饬捯饬。HIF-1普遍存在于人和哺乳动物细胞内，常氧下(21%O2)也有表达，但合成的HIF-1蛋白很快即被细胞内氧依赖性泛素蛋白酶降解途径所降解，只有在缺氧条件下HIF-1才可稳定表达。HIF-1是一种异源二聚体,,HIF-1α亚基必须与HIF-1β亚基聚合形成异二聚体,才能发挥转录因子的作用。HIF-1α基因定位于人的14号染色体q21~24区,受缺氧信号的调控,是HIF-1的活性亚基，HIF-1β亚基基因定位于人的1号染色体q21区,在细胞内稳定表达,起结构性作用;HIF一1β亚基在细胞浆中稳定表达，而HIF一1α亚基在翻译后即被泛素一蛋白酶水解复合体降解。因此，在正常氧饱和度下的细胞中基本检测不到HIF一1α亚基的表达，而在缺氧状态下， HIF一1α亚基的降解被抑制，1α和β亚基形成有活性的HIF一1，转移到细胞核内调节多种基因的转录。
作者CA9来源于既往的研究。其实就是缺氧条件下，CA9是如何调节胰腺癌生存的研究。既往研究表明缺氧条件下，可以促进HIF1A和HIF2A的稳定性。作者改造PK-8细胞表达多西环素(DOX)诱导的针对KRAS或非沉默对照(ShNS)的小发夹RNA(ShRNAs)，并检测KRAS基因敲除对缺氧反应的影响。（这是一波什么操作，DOX可以诱导对于KRAS的shRNA？）我查了一下DOX是微管抑制剂啊，作用于细胞周期的。低氧条件下RAS基因敲除伴随着HIF1a水平的降低和CA9表达的抑制，以及转录因子YB1和单羧酸转运蛋白MCT4的表达减少。
作者为了确定KRAS、MEK和ERK信号是否参与缺氧培养的PDAC细胞对HIF1a和CA9的调节，使用了MEK抑制剂曲美替尼。将人PDAC细胞和来源于KPCY GEMM15的同源PDAC肿瘤细胞克隆与曲美替尼孵育72小时后，ERK磷酸化受到抑制，ERK调节的转录因子ETS1和YB1的表达减少，与沉默KRAS表达类似，曲美替尼暴露与HIF1a水平及其核定位降低以及CA9表达降低有关。MEK抑制剂AZD6244可以有相同的效果。
接下来，作者进一步确定Ras、MEK和ERK信号是否在转录或翻译水平调节HIF1a以介导CA9表达上调，作者用了转录抑制剂和翻译抑制剂，然后，PK-8细胞与主动转录抑制剂放线菌素D孵育并不影响缺氧诱导的HIF1a蛋白的增加，这表明在缺氧条件下MEK抑制的情况下，转录变化不能解释HIF-1蛋白的丢失。相反，与蛋白质合成抑制剂环己胺孵育细胞完全阻断缺氧介导的HIF1a的诱导，这种作用在曲美替尼存在下保持不变，表明KRAS、MEK和ERK通路在转录后调节HIF1a。那HIF-1是在什么水平调控的CA9呢？作者在补充文件里说了，其实是在转录水平调控的，无非就是加上这些个抑制剂观察mRNA或者pro变化情况。
由于缺氧时HIF1a和HIF2A的表达增加可以通过蛋白质稳定来实现，因此作者研究了KRAS信号是否调节了这一途径，蛋白酶体抑制剂MG132在常氧条件下孵育PK-8和PK-1细胞，如预期的那样导致HIF1a和HIF2A的积聚，而与曲美替尼和MG132孵育则导致HIF1a的积聚减少。
由于KRAS基因缺失和曲美替尼暴露阻断了缺氧时HIF1a水平和CA9的表达，作者研究了阻断RAS信号对CA9介导的代谢参数(如pHi稳态和糖酵解)的影响。与对照细胞相比，DOX诱导的KRAS耗竭和曲美替尼暴露均导致PK-8细胞在常氧和低氧条件下的pHi显著降低。CA9的过度表达挽救了随着KRAS的缺失而观察到的pHi的下降，将PK-8细胞暴露于曲美替尼也显著降低了常氧和缺氧条件下的糖酵解功能，这些代谢变化伴随着抑制低氧介导的CA9、葡萄糖转运体1和MCT4的增加。最后，作者评估了KRAS耗尽对PDAC球体生长的影响。与shNS对照组相比，DOX诱导的PK-8细胞中KRAS的耗竭导致球体明显变小。
总结一下，以上就是为了说明一个问题，ERK和MEK途径调节了HIF1的翻译水平的活性，可以促进HIF1翻译增多，HIF在常氧条件下迅速别蛋白酶降解，在缺氧的条件下稳定存在，HIF1可以在转录水平促进CA9的转录，而CA9促进了肿瘤在KRAS突变条件下的糖酵解（反应在糖酵解相关的酶GLUT1和MCT4上）。
结合既往的研究kras及HIF1是预后 的危险因素，作者在TCGA数据挖掘了KRAS突变条件下与缺氧信号调节基因水平变化（这是基于乳腺研究的数据），发现CA9的高水平表达与高低氧适应集群中的患者显著相关，然后，作者进一步又发现了不同缺氧水平CA9的差异也是有统计差异，而且CA9的表达水平也是呈递增趋势的，与患者预后也是相关的。然后，作者在肿瘤组织中看看CA9的表达情况，发现在66%的PDAC组织中CA9都有表达，说明了这个基因表达相当普遍。作者进一步在转移灶中测了CA9的表达情况，发现CA9在转移灶中也存在表达升高的情况。提示CA9可能与肿瘤转移可存在相关性。
以上也只是说明了CA9与HIF1的调节方式，还没有达到机制的水平。下面作者进一步研究了CA9的细胞表型。作者在KPCY鼠中发现CA9与肿瘤的分化相关。
将Penn 6620c1原位植入同基因小鼠体内，肿瘤显示CA9、葡萄糖转运蛋白1和MCT4的异质性区域染色，表明存在CA9阳性的缺氧灶。作者又用这种细胞尽心了敲减CA9
当这些细胞在Matrigel中培养成球形时，CA9表达的下调显著降低了这些细胞的生物发光，表明沉默CA9可以抑制这些细胞的生长
将shNS和shCA9#26620c1细胞原位导入同基因小鼠，并在具有免疫功能的情况下评估CA9缺失对PDAC进展的影响。CA9缺失导致移植后第21天的生物发光减少.
然后作者又沿着了在CA9缺失时细胞的phi变化。这些结果表明，抑制CA9会削弱它们在缺氧条件下调节pHi的能力，潜在地导致肿瘤在体内的生长和扩散减少。
抑制CA9可以抑制肿瘤细胞的侵袭和调节PHi的能力，那么，对于吉西他滨治疗敏感性会怎么样呢？（这里作者不知为什么要做药物表型，估计是不知道下面该做什么了吧，因为胰腺癌缺氧情况，导致肿瘤的化疗反应并不理想。所致做做药物，可能会好点，凡是做肿瘤的都可以做做药物表型，但是对文章的深度好像没有多大影响。）
作者用双色活细胞显像确定了吉西他滨暴露对PDAC细胞活性的影响。与常氧培养的PK8细胞相比，低氧培养的PK8细胞的细胞毒性指数随吉西他滨浓度的增加而显著降低(图4A和补充图4A)，表明缺氧增加了这些细胞对吉西他滨的耐药性。此外，PK-8细胞与吉西他滨孵育导致HIF1a和CA9表达水平升高
PK-8细胞与吉西他滨在常氧条件下孵育显著增加糖酵解和线粒体功能，CA9耗竭不影响糖酵解的基础水平，但显著抑制吉西他滨诱导的细胞外酸化率的增加，而基础和吉西他滨诱导的线粒体功能都受到影响。
作者评估了在低氧条件下培养的pk-8细胞中的类似参数，尽管hif1a的水平随着吉西他滨的暴露而增加，但CA9并且不会进一步增加。作者发现低氧条件下糖酵解增强，但是线粒体功能减弱。我猜测这里为什么HIF1与CA9变化并不一致，可以发现HIF1可能会以很高的效率转录CA9，即使在很低水平的HIF1也能达到最大的转录水平。那按照进化论的观点来看，这个功能完全没有必要啊，显然HIF1是不是还参与了缺氧或者药物诱导的其他过程之中去了呢？
这些数据强烈表明，抑制CA9会削弱这些细胞调节pHi的能力，并抑制化疗诱导的应激反应，从而潜在地增加它们对吉西他滨的易感性。但是在常氧状态下，吉西他滨又能诱导HIF1表达升高，这就有意思了，因为在常氧生理条件下这个HIF1是迅速降解的，显而易见吉西他滨抑制了线粒体的功能，造成了细胞内缺氧环境，是不是这样也是吉西他滨耐药的一个机制呢？也可以说是不是肿瘤对吉西他滨产生了被动抵抗的能力？
于吉西他滨暴露增加了常氧条件下PK-8细胞CA9的表达，作者评估了药物抑制CA9活性是否会增强化疗敏感性。细胞与浓度增加的吉西他滨在50 mM的slc0111存在下孵育，与这些细胞耗尽ca9对吉西他滨诱导的代谢流量的影响一致，与单用吉西他滨相比，联合孵育显著增加了细胞毒性。与常氧条件下相比，缺氧条件下，吉西他滨和SLC-0111联合使用的细胞毒效应的总体程度有所降低。
最后，作者确定PDAC细胞与SLC-0111孵育是否也影响pHi稳态。PK-8细胞在低氧条件下培养72小时上调CA9，然后与50 mMSLC-0111孵育，导致pHi显著降低，然后，确定了CA9阳性与阴性肿瘤在SLC-0111及吉西他滨条件下的增殖和侵袭情况变化，结果说明CA9可能是肿瘤化疗增敏的一个关键。
作者细胞的表型和机制都做的差不多了，下面开始做体内部分。在一组人PDAC细胞系中评估了HIF1a和肿瘤相关CA的水平。所有细胞株均显示缺氧时HIF1a表达水平升高，7个PDAC细胞株中有4个(58%)表现出缺氧诱导的CA9表达，这表明尽管PDAC细胞通常在缺氧应激下上调CA9，但确实存在异质性，CA9可能独立于缺氧介导的HIF-1被调节。
作者选择了表现出强烈的低氧诱导CA9上调的细胞系，建立了肿瘤，并用免疫组织化学方法评估了CA9的表达。来自KRAS突变PK-8和PK-1细胞系的肿瘤显示CA9表达呈肿瘤体积依赖性染色。然后，从CA9表达缺失的PK-8细胞中建立了肿瘤，并证明这些肿瘤的CA9表达为阴性。
与载体对照组相比，CA9耗尽或单独注射吉西他滨显著提高了存活率。与单一干预方案相比，联合方案通过显著延长生存期进一步提高了疗效。
作者又进一步作了SLC-0111联合吉西他滨体内治疗KRAS突变型PDAC的作用。与单独使用吉西他滨相比，给PK-8移植瘤使用SLC-0111和吉西他滨显著降低了肿瘤生长.为了确定抑制CA9与吉西他滨联合应用是否会导致瘤内酸中毒和细胞活力的改变，作者评估了肿瘤酸中毒的生物标志物溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)的存在和分布和裂解的caspase3。在吉西他滨暴露的肿瘤中，LAMP2定位于细胞质的核周区域，并呈现点状表达模式，但向膜局部化表达的聚集转移。在这些肿瘤中，LAMP2膜定位表达阳性的细胞数量显著增加，在给予联合用药的肿瘤中，caspase3裂解阳性的细胞显著增加。
同样，暴露于吉西他滨的pk-1异种移植瘤显示出LAMP2染色的点状图案，而联合用药则导致膜局部化染色显著增加。
为了验证吉西他滨和SLC联合应用在肿瘤治疗中的临床意义，作者用了PDX模型，并用paca 83-2 pdx细胞作了体内实验。对照组动物在最初给药后70天内死于疾病，而服用SLC-0111的一些动物显示存活增加。16周后的分析表明，虽然与SLC0111或赋形剂相比，单独注射吉西他滨可以延长生存期，但联合用药进一步增加了生存期。
作者使用KPCY GEMM评估联合用药对PDAC肿瘤免疫微环境的潜在影响。动物给予吉西他滨和SLC-0111治疗14天，然后进行瘤内B和T淋巴细胞的免疫组织化学分析。与对照组和单一药物相比，联合用药导致B220塔B细胞明显减少，而对CD3T细胞的数量没有显著影响。
本来以为作者还要加上免疫靶点的药物，但是然并卵，文章到此结束，总体来说，还是挺好的文章。我只是对一些小细节并不是特别理解，可以进一步研究、研究。欢迎批评、指正。