三十六策 第 11 策 见微知著

三十六策 第 11 策 见微知著

三十六策 第 11 策 见微知著

miRNA 研究的优势

第一，miRNA 是非编码 RNA，没有蛋白 表达差异、验证基因过表达还是沉默的效率，只需要 qPCR 验证

第二，miRNA 是短片段，直接合成就行，转染效率高，不需要用病毒载体

第三，探索分子机制，miRNA 有一套固定的机制模式：miRNA一般作用于靶基因的 3’-UTR 引起下游靶基因表达沉默 荧光素酶报告基因实验

已知 miRNA 预测它的靶基因→有现成的数据库

miRNA 的规范化套路

miRNA 第一个特征是长度整齐划一，都是 19-25 核苷酸的单链 RNA 片段，在物种之间保守性比较好，突变的概率小。

成熟的miRNA分子可以跟一个或多个mRNA分子不完全匹配的互补结合，一旦结合上就可以下调基因的表达。miRNA主要作用位点在靶基因的3’-UTR，依赖于RISC沉默复合体发挥作用

查询 miRNA 的权威数据库是 miRBase

现在的 miRNA 命名，起头先用物种名称，如人的是 hsa，小鼠是 Mmu，大鼠是 Rno ，物种后面加一个横杠接 miRNA 简写成 miR/mir，再加个横杠接序号数字。

如果遇到新发现的 miRNA 跟已有名称的高度同源的情况，序列只差 1-2 个碱基，区分开来没法体现这种序列和功能上的相似性，那就在第一个发现的 miRNA 后加上小写的 a/b/c 这样区分。

如果一条 miRNA 可以来源于不同的 DNA 编码区域，也就是在基因组有平行的多个拷贝，那么还要在 a/b/c 后面加个横杠再以数字 1/2/3 来表示。

物种-miR-数字序号+字母-5p/3p

功能基因 5 步法研究套路:

1)检测基础表达水平;2)制备分子操作工具;3)细胞功能表型实验;4)动物水平表型验证;5)Rescue 实验。

先筛、猜分子，在五步法里完成前面三步就已经得到了细胞水平的表型结果，过表达加沉默一正一反的双向研究， 在找候选分子的时候只要先做一个方向就行了，在疾病中高表达的分子做沉默验证，低表达的分子做过表达，目标是抑制或者缓解致病的表型。

套路执行的第一步还是分析 miRNA的表达差异情况，包括细胞和组织水平的检测。

蛋白可以做免疫组化、免疫荧光，miRNA 只需要做 RNA 水平用实时定量 PCR(Real-time PCR)来验证就行了。

第二步是制备 miRNA 过表达或者抑制的实验工具，这一步基本等同于做 RNA 干扰时候合成 siRNA 片段。

miRNA 过表达有个专用名词叫 mimics(模拟物)

miRNA 的沉默叫 inhibitor(抑制物)

用定量 PCR 来检测一下，这一步也不需要 Western

第三步细胞表型验证，同样研究一个表型，模型一样、Assay 一样、Biomarker 一样往里套就好了。

找 miRNA 的靶基因

机制(Mechanism)

• 解释一个分子介导某种表型背后的原因就是分子机制

• 变量分子和通路组合在一起，通路就是解释分子发挥功能的机制

• 药物和分子组合在一起，分子就是解释药物为什么有效的机制

• 药物也可以跟通路串联在一起，用通路变化来解释药物起效的机制

机制研究的两个层次：知其然不知其所以然 和 知其然知其所以然。

• 知其然不知其所以然是间接作用机制，是分子机制的初级层次，知道了主变量通过影响下游另外一个因变量发挥功能，但是他们之间具体怎么调节的，不清楚，仅仅解答了 Why 的问题。

• 知其然知其所以然是直接作用机制，是分子机制的高级层次，不但知道有调控关系，而且知道直接作用的靶点和方式是什么。在 Why 的问题基础上，How 的问题也有了解释。

  • miRNA 靶向作用于下游一个编码基因，是最简单的一种机制模型

  • miRNA 为主变量的研究项目只要有分子机制一般就是做靶基因，这是一种直接作用机制

  • 在预测 miRNA 靶基因方面最权威的数据库是 Targetscan

  • 实验验证是不是潜在靶基因，只需要在细胞株中过表达 miRNA 然后 qPCR，WB 检测一下，选出 miRNA 过表达以后表达下调的预测靶点。找到这种有显著负调节关系的预测靶基因后再加一个 Luciferase assay，就可以证明直接调控作用了。

  • 荧光素酶报告基因实验：用在 miRNA 靶基因验证；在研究转录因子对启动子的调控活性

阻遏翻译和引导 mRNA 降解是两种机制，一个 miRNA 过表达，其靶基因 mRNA 可能表达降低，也可能变化不显著，但在蛋白水平应 该表现为明显的降低，

总结

功能基因研究五步法基础上，往里换一个miRNA分子，整体数据框架是一致的。前面四步miRNA的套路跟功能基因一样，只是操作细节略有区别，总体而言miRNA实验比蛋白更好做。第五步Rescue跟前面套路不太一样，单变量的Rescue，只适合功能基因，不太适合非编码RNA。而且我们已经提出了miRNA的靶基因验证，那么Rescue也不再是单变量的Rescue了，而是上下游具有调控关系的分子间的rescue验证策略。