文献学习048--[sc]Cross-tissue organization of the fibroblast lineage

成纤维细胞由功能不同的细胞群体组成，这些群体根据其来源的组织和与之相关的疾病而不同。此外，即使在一个组织中，也不是所有的成纤维细胞都是一样的。离散的、不重叠的成纤维细胞亚型驱动着这些细胞的许多生物学功能的不同方面。在一项新的研究中，美国研究人员构建出不同组织中的成纤维细胞基因表达的比较图谱，揭示了同一器官内和不同器官的成纤维细胞谱系的一般组织原则（organizing principle）。这项研究表明，成纤维细胞存在通用的（universal）、特化的（specialized）和疾病特异性的（perturbatione-specific）亚群，并指出这三种亚型有一个共同的祖先。

这篇文章的分析做的实在是太好了，以至于我觉得一样的idea，一样的数据，我都分析不出这样的结果，佩服。

成纤维细胞遍布所有组织，通过产生和重塑细胞外基质蛋白 (ECM) 来塑造器官的形态，长期以来，从同一组织或不同组织中分离出来的成纤维细胞之间的家族关系一直是个谜。原因之一是，在出现对单细胞中的RNA进行分析的方法之前，很难将成纤维细胞分为不同的亚型。所有成纤维细胞都执行与其谱系相一致的类似功能，如制造和修改细胞外基质的分子。然而，它们也可以执行专门的程序，以适应它们所居住的特定组织的需求。例如，特化的成纤维细胞支持骨髓中造血（血液和免疫）细胞的发育。成纤维细胞如何实现通用和特化的功能一直不清楚。
造血细胞，如免疫系统的巨噬细胞，通过采用共享的、全谱系的、核心的基因表达模式，然后辅以微环境线索驱动的组织特异性基因表达，解决了具有通用功能和特化功能的问题。巨噬细胞由一种称为单核细胞的细胞类型补充。单核细胞在血液中循环，并作为组织巨噬细胞产生的通用库。到目前为止，尚未解答的问题是，成纤维细胞是否遵循这种巨噬细胞的方法，或者在一个特定的组织中，成纤维细胞是否存在另一种情况，即一个“通用的”、泛组织的成纤维细胞前体细胞亚群与这些细胞的一个更成熟的、组织特异性的亚群一起存在。
既往的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究一定程度上揭示了组织内成纤维细胞的异质性¹，揭示了组织内成纤维细胞具有的临床意义（成纤维细胞的亚型可以导致关节炎、癌症和纤维化适应症如特发性肺纤维化 (IPF) 中的疾病）。新的证据表明，组织内的成纤维细胞亚型参与调控组织稳态和疾病的不同方面。了解不同条件下成纤维细胞表型是环境依赖的还是保守的可能会为疾病治疗提供新的线索。我们假设稳态下的组织类型差异和特定的疾病背景共同引起了成纤维细胞的异质性。

1. Fibroblasts in steady-state mouse tissues

Fig 1A：为了解决这个问题，这些作者首先整合了正常状态的16个脏器/组织的28个单细胞数据集中的PDGFRa⁺成纤维细胞。

PDGFRa：成纤维细胞标志物

Fig 1B：得到120583个细胞，分为10个亚群。网站：https://www.fibroxplorer.com
Fig 1C：展示了每个群的差异基因，细胞群的功能和所在的组织。可以看到Pi16⁺和Col15a1⁺在所有组织中都存在，这表明这两个细胞群可能代表了泛组织成纤维细胞。其余八个亚群则主要在不同的特定组织中存在。

既往文献报道过的亚群和该数据集中的亚群对应
Ccl19⁺ fibroblastic reticular cells (FRCs) ,
Coch⁺ red pulp fibroblasts,
Cxcl12⁺ mesenchymal stromal cells and osteolineage cells,
Fbln1⁺ and Bmp4⁺ intestinal fibroblasts,
Comp⁺ fibroblasts,
Npnt⁺ alveolar fibroblasts
Hhip⁺ peribronchial fibroblasts

Fig 1D：Slingshot拟时序的结果提示Pi16⁺成纤维细胞是分化起点，其先分化成Col15a1⁺成纤维，随后分化成多种不同的成纤维细胞。
这些结果提示了通用的（universal）和特化的（specialized）成纤维细胞的存在，而且它们之间存在分化关系。通用成纤维细胞的作用包括分泌ECM，其中 Col15a1⁺ 通用成纤维细胞表现出分泌基底膜蛋白的能力，可能参与调节细胞外基质。而位于血管附近的Pi16细胞可能作为组织成纤维细胞起源的储存细胞。

2. Dpt^IRESCreERT2 mouse validates scRNA-seq

随后作者通过流式检测了Pi16⁺ (LY6C⁺SCA1⁺)和Col15a1⁺ (LY6C⁻SCA1⁺) universal fibroblasts，以及specialized fibroblasts (LY6C⁻SCA1⁻)，结果显示PDGFRα ⁺成纤维细胞在11个组织中都可以分为3群。This approach confirmed the existence of bona fide universal and specialized phenotypes.

为了验证这一假设，这些作者着手寻找可用于识别Pi16和Col15a1成纤维细胞的细胞表面标志物。研究显示存在一组基因，其表达与成纤维细胞的特化成相反关系：在Pi16成纤维细胞中高度富集，在Col15a1成纤维细胞中则较低程度富集。在这些基因中，他们着重研究了Dpt，它是Pi16和Col15a1通用成纤维细胞的一种潜在的标志物。

随后作者构建了表达Dpt编码蛋白的荧光鼠，通过新下面的策略可以造成Dpt表达的细胞同时表达YFP，随后可以通过荧光筛选出Dpt+的细胞或进行示踪。
参考：Cre小鼠的简介与应用

YFP在正常的细胞里面由于前面表达了stop元件是不能表达的，但是现在Cre通过IRES元件与Dpt共表达，有Dpt的，就会有Cre；有了Cre，就可以剪切stop，使得YFP表达。(LSL是指Lox-stop-Lox盒结构)

Fig 2A：Dpt^IRESCreERT2Rosa26^LSLYFP小鼠被给予含tamoxifen饮食14天。在11个被检测组织中，PDGFRα⁺成纤维细胞都显著表达YFP。(这张图是live, EpCAM⁻CD45⁻CD31⁻PDPN⁺PDGFRα⁺的胰腺成纤维，其他组织的图在附件。Red: Dpt^{IRESCreERT2ki/ki}Rosa26^{LSLYFPwt/loxP}; Grey: Dpt^{IRESCreERT2wt/wt}Rosa26^{LSLYFPwt/loxP})
Fig 2B：不同脏器中的重组效率不同，淋巴结显示出最低比例的 YFP⁺成纤维 (28.7 ± 5.5% (mean ± s.e.m.)) ，心脏最高 (83.7 ± 3.1%)。

正常状态下心脏里的成纤维绝大多数都是通用成纤维
（但是文章里都没有鉴定出心脏specialized和perturbatione-specific的成纤维细胞）

Fig 2C-D：The distinction between universal and specialized fibroblasts was also observed at the protein level via YFP expression in Ccl19^YFP and Gremlin1^CreERT2Rosa26^LSLYFP mice. （用了两种特化成纤维细胞的示踪鼠）
C图展示了Ccl19^YFP小鼠淋巴结的Pi16⁺ (LY6C⁺SCA1⁺)和Col15a1⁺ (LY6C⁻SCA1⁺) universal fibroblasts，以及specialized fibroblasts (LY6C⁻SCA1⁻)细胞中YFP的表达，D图展示了Grem1^CreERT2wt/kiRosa26^{LSLYFPwt/loxP}小鼠三种细胞中YFP的表达。
Fig 2E：Dpt^IresCreERT2Rosa26^LSLYFP小鼠淋巴结，肺和其他组织中YFP的表达趋势则和前面相反。

3. Fibroblasts in perturbed mouse tissues

为了探究perturbed状态下的成纤维异质性，作者随后对感染，损伤，肿瘤，纤维化，代谢改变和关节炎情况下的成纤维数据进行了分析。
Fig 3A：整合了来自17个数据集13个组织成纤维细胞，得到了PDGFRa⁺的perturbed-state fibroblast atlas。
Fig 3B-C：聚类得到10个cluster： Pi16⁺ , Col15a1⁺ , Ccl19⁺ , Cxcl12⁺ , Comp⁺ , Npnt⁺ , Hhip⁺ , Adamdec1⁺ , Cxcl5⁺和Lrrc15⁺。

> Pi16⁺ 和Col15a1⁺这两个群高表达Dpt，属于通用成纤维细胞
> Ccl19⁺ , Cxcl12⁺ , Comp⁺ , Npnt⁺ , Hhip⁺ 这几群则和正常组织中同名的特化细胞群在基因表达和组织分布上都很相似。
> Adamdec1⁺ , Cxcl5⁺和Lrrc15⁺这几群则似乎代表了在正常状态中不存在的perturbation-specific活化的成纤维细胞。

^{⚠️三群细胞中只有Lrrc15+是表达Acta2的肌成纤维细胞，其他两群只是活化的成纤维，不是肌成纤维细胞。}

Cxcl5⁺群主要存在于early muscle injury，并高表达趋化因子如Ccl2和Ccl7。Adamdec1⁺群则主要存在于colitis，并高表达Il11和Grem1。Lrrc15⁺细胞群则存在于arthritis, skin wound, fibrosis和small and large pancreatic ductal adenocarcinoma等疾病，这群细胞还高表达Cthrc1, Acta2, Postn和Adam12以及胶原，提示这群细胞代表myofibroblasts。
Fig 3D：作者随后探究了universal fibroblasts是否是 LRRC15⁺ myofibroblasts的起源。作者使用了Dpt^IresCreERT2;Rosa26^LSLYFP小鼠的皮下肿瘤模型，发现Dpt^{IresCreERT2ki/ki}小鼠中，52 ± 7%的LRRC15⁺ myofibroblasts是YFP阳性的。提示表达在肿瘤发生前标记的Dpt的通用成纤维细胞在肿瘤状态下可以分化为LRRC15⁺myofibroblasts。

4. Single-cell RNA-seq of human fibroblasts

最后作者在人的组织上验证了前面的结果
Extended Data Fig. 9A-C：作者对3例胰腺癌患者的癌和癌旁组织进行了单细胞测序，得到21262个细胞，鉴定出了C3和C8这两群成纤维细胞。C3是肿瘤相关成纤维细胞(CAF)，C8则是正常成纤维。
Extended Data Fig. 9D-E：为了探究C8是否代表着人通用成纤维细胞，作者将C8的20 most upregulated定义为人通用成纤维表达模块，并使用GTEx数据库推断了不同组织中这些细胞的丰度。
Extended Data Fig. 9F-G：结果显示在包括正常胰腺的12种人类组织中都发现了人通用成纤维表达模块基因的强共表达(r > 0.5)
Extended Data Fig. 9H-I：在单细胞水平，人通用成纤维表达模块基因在胰腺和脂肪组织中被观察到。

Extended Data Fig. 9

Extended Data Fig. 10A：随后作者比较了C3和C8的差异基因，使用C3的上调基因作为human fibroblast activation program。
Extended Data Fig. 10B：universal和activated gene programs之间存在强负相关 (r = −0.54)。提示人成纤维细胞的活化可能与通用成纤维细胞的基因表达丢失有关。和小鼠中观测到的相一致。

Extended Data Fig. 10

随后作者探究了人类中观测到的成纤维细胞亚型是否在小鼠中有对应，发现人类C3 signature在小鼠Lrrc15⁺ myofibroblast中富集，而且这并不局限于胰腺癌，在类风湿性关节炎，间质性肺炎，IPF，溃疡性结肠炎中都观测到了这种现象。

Fig 4A：最后作者通过整合c3 PDAC CAFs, colitis患者的结肠成纤维细胞核IPF，非小细胞肺癌和新冠患者的肺成纤维细胞， 构建了human perturbed-state atlas。
Fig 4B-C：一共得到了10,355个细胞，分为6个细胞群。这些群中包括一个PI16⁺细胞群，代表了人类通用成纤维细胞群；主要存在于肺脏疾病中的NPNT⁺肺泡成纤维细胞；主要存在于结肠癌患者中的ADAMDEC1⁺和CCL19⁺细胞群；还有两群LRRC15⁺和COL3A1⁺肌成纤维细胞。
Fig 4D：LRRC15⁺肌成纤维细胞在胰腺癌和肺癌中比较多，COL3A1⁺肌成纤维细胞则主要存在于肺癌。

人类扰动状态成纤维图谱从各个方面验证了小鼠扰动状态图谱，包括 LRRC15⁺ 肌成纤维细胞和 ADAMDEC1⁺ 成纤维细胞，但也表明在人适应症特异性刺激下或不同信号持续时间可能会驱动未在小鼠中看到的额外肌成纤维细胞群类型。

Discussion

这些作者的这项具有里程碑意义的研究具有深远的意义。它确定了健康和疾病中成纤维细胞谱系的关键组织原则。虽然巨噬细胞与成纤维细胞一样，是在组织中寻找危险信号的哨兵细胞，但是与巨噬细胞不同的是，成纤维细胞谱系可分为三种主要亚型：通用的亚群和特化的（稳态的）亚群，以及激活的（扰动状态的）亚群，所有这些亚型可共同存在于同一组织中。小鼠中的某些成纤维细胞和人类中的某些成纤维细胞之间的一致性特别有意义，因为它表明小鼠中的机理研究可能与人类疾病有直接关系。此外，这项研究提供了一个资源，将有助于澄清术语，提高对不同组织的特定成纤维细胞亚型的识别精度。为了使目前在临床研究中作为细胞疗法修复组织的成纤维细胞亚群标准化，迫切需要这样的研究进展。
这些发现最令人兴奋的意义也许在于，观察到特定组织中存在非重叠的疾病相关的成纤维细胞亚群，而且这些细胞与参与健康组织修复和组织特化的其他亚型不同，这可能会带来临床益处。如果能够靶向这些致病的成纤维细胞亚群，而不影响与健康相关的成纤维细胞亚群，那么就有可能以更有针对性和更少免疫抑制的方式治疗某些炎症和恶性疾病。能够靶向有害的成纤维细胞而不影响有益的成纤维细胞和造血细胞，将彻底改变许多慢性疾病的治疗。

Limitations：

同期nature评论

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Reference:

1. Koliaraki, V., Prados, A., Armaka, M. & Kollias, G. The mesenchymal context in inflammation, immunity and cancer. Nat. Immunol. 21, 974–982 (2020).