手拆sanger测序套峰结果

最近我们连续解读了3篇P53在CRISPR-Cas9基因编辑过程中的影响，目前第4篇还在撰写中。为了调剂一下文献阅读的凝重感，今天咱们更点短小精悍的。在我们之前的推文中提到过，桑格测序是CRISPR-Cas9基因编辑结果的金标准。一般我们先将多个单克隆细胞的PCR产物送测序，选择拥有套峰的单克隆细胞进行T载体连接测序，用以检验最终的基因型。关于如何解读桑格测序封图，可以参考测序公司给的文档，感兴趣也可以点击我们之前的文章：看不懂测序峰图就好像有答案都不会抄

如何判断CRISPR编辑成功，怎么拆套峰?

该怎么送样本，送什么样本进行sanger测序？什么样的sanger测序结果才是基因编辑成功的样子？这是一个比较高频率的问题。同时我们在峰图解析的文章中提到过手动拆套峰，因此如何拆套峰，也常被问到。

question

1. 该送什么样本

在获取单细胞克隆并将将细胞扩增后，一般我们会按照以下顺序准备两种样本：

（1）提取上述细胞的基因组DNA，由高保真DNA聚合酶扩增的，含有gRNA ontarget位点的DNA片段。强调一定要是高保真酶P出来的序列，我们通过观察PCR产物峰图来挑选进一步验证的单细胞克隆。

（2）将该DNA片段通过解链，与T载体连接并转化后，挑取的单菌落摇起来的菌液。

加送PCR所用的引物，选择单边用于sanger测序，原因：

（1）省钱：无需公司额外合成引物；

（2）不用公司通用引物：因为自连的T载体在通用引物下也能被测出来，只要测出来就收费。使用PCR所用的引物，可以精准跟踪目的基因的基因型变化，既省钱又免去在查阅自连载体测序结果上的时间。

2. CRISPR-Cas9基因编辑结果可能出现的峰图

我们以依赖NHEJ修复的CRISPR-Cas9基因敲除为例，可能出现的峰图如下图：

peaks

依据PCR产物峰图结果，我目前的工作流程如下：

workflow

3. 为什么要手动拆峰？

我们需要最终的基因型sanger测序结果，用于文章发表。在一切顺利的情况下，其实不花多少时间。但如果T载体连接失败或者总是只测到单边序列，急于知道基因编辑结果时，可以选择手动拆峰。

我目前的手动拆峰方法是来自于DZ师兄的言传身教，如果大家有什么新的方法，可以在评论中指出，感谢~我们的手动拆峰方法要求一定要有以下两个结果：

（1）PCR sanger测序结果：通过实验获得

（2）其中一条链的序列：通过实验获得，或者通过工具获得。

4. Poly Peak Parser：拆峰工具

如果已有实验结果获得了其中一条链的序列，我们可以直接手动拆峰。当T载连接实验总是失败时，我们也可以依据PCR产物sanger测序峰图，使用网页Poly Peak Parser推导其中一条链的序列。该网页工具的界面和使用方法都非常简单，在推荐给大家之前，我使用自己的测序结果验证过，目前没发现有错的结果，可以十分精准的推测出二倍体细胞在基因编辑后的其中一条链的序列。

Poly Peak Parser

5. 手动拆峰

工作思路如下：

（1）PCR序列：读取PCR测序结果的上峰图为PCR序列1，将套峰下峰的序列读出为PCR序列2

（2）T vector测到的/软件分析出的其中一条链的序列，我们先称之为T序列：摘取T序列和PCR序列1,2进行比对，摘取的位置从gRNA位点前（双峰出现前5-10个碱基）开始，一直到T序列突变位置结束后5-10个序列。通过同位点的上下替换，使得其中一条PCR序列和T序列一致，则剩下的PCR序列则为另外一条链的序列结果。

用文字描述非常难以理解，我们用过实际样本进行进行推测吧。

example

将PCR上峰和下峰序列读出

我们在双峰出现位点前几个碱基开始读取序列（图中蓝色选取部分）如下：

拆峰

将T载体序列和PCR上峰，PCR下峰序列抄下来比对。通过同位点碱基替换使得PCR下峰序列和T在序列一致，经替换后的PCR上峰序列，则为另外一条链的结果。将该序列保存为DNA序列，加入到软件中比对可看到，另外一条链的基因编辑结果为一个A碱基的插入。结合两条链的结果，都没有出现3的倍数的碱基缺失或插入，初步认定该细胞为成功的敲除细胞系。

final result

以上拆峰适用于二倍体的单细胞克隆细胞系。如果发现拆峰结果不匹配或者拆峰无法顺利进行（上下没有可替换的碱基），则说明该细胞可能为多倍体或者多克隆细胞系。

小结

拆峰是个手艺活，需要用眼睛慢慢看，过程可能枯燥乏味，但对trouble shooting很有帮助。同时对急于需要知道细胞基因型，才能进行下一步的实验，有这么一手还是很舒心滴！最后，欢迎小伙伴们提出自己宝贵的经验，帮助我进一步学习，感谢~

部分前期文章：

1. 我们用两篇文章的篇幅大概讲了一遍质粒骨架及其各个要素的介绍：
   解剖式学习一个质粒结构--update
   质粒系列之什么是质粒
2. 再谈了最传统的限制性克隆：
   质粒系列之限制性克隆--restriction cloning
3. 前面还夹杂的讲过一些piggybac、gateway、RMCE的一些内容：
   基因编辑如何换药不换汤
4. 慢病毒系列也有讲过两篇：
   团队作案HEK293，史上最强搬砖细胞
   不想再用慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon
5. 此外我们本还有一个CRISPR screening的专题，只有开头，未得完善：精准大海捞针--5. CRISPR screening专题
6. 质粒系列之再谈无缝连接--Gibson assembly
7. Golden Gate，质粒改造的王者
8. 关于CRISPR-Cas9技术的脱靶效应：CRISPR-Cas9基因编辑--脱靶效应如何检测
9. CRISPR和TP53文献解读之：Cas9诱导P53激活并导致细胞死亡
10. CRISPR和TP53文献解读之：Cas9活性可筛选P53突变细胞
11. 怎么肥事：P53你竟然不让我HDR精准修复！