2022-03-10石蜡切片免疫染色

石蜡切片制作
一、实验程序（1-5参考本科实验的protocol）
1.取材：用锋利的刀片切取材料。
2.固定：将已切好的材料放入10%的福尔马林溶液中固定12-24小时。固定剂一般为组织块体积的10-15倍。
3.放入全封闭式脱水机中（由于是皮肤组织不用洗涤直接放入脱水机中）。脱水机可以进行酒精脱水，透明和透蜡这三步。
酒精脱水：一般经50%、70%、85%、95%直至纯酒精。每级停留约30分钟至1小时。如需过夜，应停留在70%酒精中。
透明：材料先在纯酒精和二甲苯各半的混合液浸15—30分钟，再转入纯二甲苯中透明（至透明为止），一般15—30分钟。
透蜡：材料自二甲苯中取出后,先移入二甲苯和石蜡等量的混合液中约30分钟，然后进入纯石蜡中约40—60分钟，再换纯石蜡一次约40—60分钟。
4.自动包埋机中包埋样本。
5.切片并贴片。
6.染色的一般方法
由于要染的切片包在石蜡之中，而所用的染色剂又常常为水溶液，因此在染色之前，必须再度复水，石蜡切片在二甲苯中溶去石蜡，经过各级酒精，下降至水，经染色后需再脱水，上升到二甲苯透明然后封藏。
脱蜡至水
(1)二甲苯脱蜡5-10min（建议10min）。
(2)二甲苯与纯酒精等量混液5min。
(3)纯酒精，95%、85%、70%、50%酒精各2min。
(4)蒸馏水5min(置于摇床上)，2次。

苏 木 精——伊 红 （简称 H.E）对染法
(参考网站：SPERIKON:免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决方案汇总)
(5)埃利希氏苏木精染色液20-30min。
(6)水洗(换几次，共约5min)。
(7)1%盐酸酒精分化数秒钟(如染色合适，此步可取消)。
(8)自来水洗数秒至1min。
(9)氨水中“蓝化”3~4s。
(10)蒸馏中漂洗5min(换一次)。
(11)1%伊红水溶液1~5min。
(12)70%酒精数秒。
(13)80%、95%、纯酒精(2次）各2min。
(14)纯酒精与二甲苯等量混合液5min。
(15)二甲苯5—10min。
(16)封藏: 封藏于中性树胶中。
封藏的方法：在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触，然后再缓慢地放下，避免产生气泡。

免疫荧光抗体染色
（参考网站：BAIYUE:分子实验-石蜡切片免疫组化染色实验流程（免疫荧光染色方法））
(5)抗原修复:由于甲醛固定导致组织上很多抗原的免疫活性丢失（氨基交联和蛋白三级结构变化，尤其是苯环结构位置变化，会导致抗原决定簇位点发生改变），无法直接标记染色。所以染色前要先做抗原修复。这步很重要。
选择抗原修复的方法因抗体而异。包括高压锅处理法，微波处理法，酶消化法。
选择市面上的抗原修复液：修复液的PH加热温度和时间也很重要。

PH8.0的EDTA+微波较温和：比较适合胞膜和大部分细胞质抗原。效果也还可以，实操性强，但是温度不好控制，很容易修复不完全导致假阴性。
PH6.0的枸橼酸钠+高温高压相对较激烈：可扩张细胞膜和核膜的膜孔，适合细胞膜和部分细胞质抗原。但是这种方法稳定性最好，可重复性强。
消化酶对相当一部分抗原没有修复作用，如S-100蛋白，波纹蛋白等。对某些膜抗原，激素受体，癌基因等有破坏作用。效果最差。
微波修复法：参考：ANTPEDIA：微波修复抗原
条件待优化
（7）通透
（8）封闭
（9）一抗孵育
（10）荧光二抗孵育
（11）复染核：在玻片上滴加DAPI，避光孵育5min,然后PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI.
（12）封片及荧光观察：用吸水纸吸干片子上的液体，用含有抗荧光猝灭的封片液封片，然后在荧光显微镜观察。

写在最后：其实免疫荧光染色从脱蜡至水那步到后面的染色这个步骤，买抗体的时候，有些公司会附上这些步骤的使用方法，包括推荐用什么封闭液和封片液。可以直接按照他们的推荐来，做不出来他们还会帮你优化条件，感觉还是挺靠谱的。