Integrative multi-omics and drug response profiling of childhood acute lymphoblastic leukemia cell lines
儿童急性淋巴细胞白血病细胞系的综合多组学和药物反应谱分析
发表期刊：Nat Commun
发表日期：2022 Mar 30
DOI: 10.1038/s41467-022-29224-5
一、背景
急性淋巴细胞白血病（ALL）占所有儿童癌症的30%，是最常见的儿童癌症。尽管广泛的化疗方案和异体造血干细胞移植（HSCT）在临床上取得了成功，但仍有相当数量的患者（15-20%）生存状况不佳。因此，弥合ALL治疗方案的差距可能需要开发药物和细胞疗法；而这一过程将取决于对无反应亚型的生物标志物和生物学特性的深入研究。
考虑到转录后和翻译后的机制对每个细胞成分的蛋白质水平有不同的影响，其方式由细胞健康要求决定，蛋白质组代表了理解细胞表型的理想框架。最近的研究表明，癌症的蛋白质组和基因表型之间的相关性很差，包括儿童ALL。
二、材料与方法
1.数据来源
49个儿童ALL细胞系和两个EB病毒转化的B细胞系
2.实验流程
1）细胞培养、质谱分析的样品制备、肽的高分辨等电聚焦(HiRIEF)、HiRIEF馏分的LC-MS/MS运行、LC-MS/MS运行分析
2）ALL细胞系的药物敏感性和耐药性测试
3）CETSA分析、西方印迹法、通过流式细胞仪评估细胞存活率、RNA测序和转录组分析、转录组学数据的融合分析
4）转录组学数据的差异表达（DE）分析：基于RNA的差异表达分析是用edgeR进行的；FeatureCounts用于组装原始计数矩阵，edgeR使用该计数矩阵来进行基于负二项分布的差异表达分析
5）高变异蛋白的鉴定：使用期望最大化方法（EM）来估计不同的混合物成分
6）蛋白质组学数据的聚类：向聚类程序提交了三个不同的数据集：全部细胞系、仅B细胞（BCP-ALL，B-ALL）和仅T细胞（T-ALL）；使用R软件包ConsensusClusterPlus进行共识聚类算法
7）转录组学数据的共识聚类：其方法与蛋白质数据类似；使用ggalluvial R软件包中实现的Sankey图来比较RNA和蛋白质聚类；使用pvclust R包确定近似的自举概率来评估RNA簇的不确定性。
8）蛋白质组学数据的差异丰度分析：使用DEqMS进行
9）相关性分析：使用64个匹配样本的转录组和蛋白质组数据之间的重叠基因（n = 8981），进行每个基因的mRNA和蛋白质水平之间的相关性；对43个有DSRT的细胞系的所有量化的蛋白质（n = 12,446）的sDSS和蛋白质丰度之间的相关性分析也使用Pearson Rank Correlation进行
10）基因组富集分析：GSEA
11）复合调控分析：研究蛋白复合物的调控，使用所有细胞系的mRNA-蛋白相关性来计算CORUM复合物
12）药物与蛋白相关性的UMAP
13）差异相关分析：使用DGCA软件包进行差异相关分析81，应用于BCP-ALL（B_Lineage）或T-ALL（T_Lineage）中药物和蛋白质的sDSS之间计算的皮尔逊相关性
14）流式细胞仪数据的统计分析：所有的量化都是使用BD FacsDiva软件（BD Biosciences）进行的
三、实验结果
01 - 儿童ALL细胞系深入的多组学分析
作者通过检查蛋白质和RNA水平以及药物敏感性（图1a）对51个现成的细胞系进行了深入分析，这些细胞系代表了具有不同细胞遗传背景的29个B系和22个T系细胞系（图1b）。基于液相色谱-质谱（LC-MS）对细胞系的蛋白质和多肽进行定量分析，并在随后的分析中鉴定和定量了279351个多肽，这些肽被分配到13704个蛋白质，来自12446个基因（图1a）。多重化是通过使用串联质量标签（TMT）的肽标记来实现的，在几个TMT组中，SEM细胞系的技术和/或生物重复被用于分析方法学的变异性（补充图1a）。大多数细胞系的生物复制相隔1年左右，每个细胞系的所有重复序列组合在一起（补充图1b）。使用核糖体耗尽的总RNA对所有51个细胞系进行了转录组分析，另外还对15个具有匹配蛋白质组样品的复制体进行了分析（图1b），对43个细胞系进行了药物敏感性和耐药性测试（DSRT），使用了528种被批准的肿瘤药物以及研究中的药物（图1a）。
蛋白质组图谱的主成分分析（PCA）分离出四个主要的细胞系谱系关联组（图1c）。在这个分析中，来自T系和B系的细胞系被明确分开，B系细胞系被进一步区分为B细胞前体急性淋巴细胞白血病（BCP-ALL）和B-ALL细胞系。两个细胞系（CCRF-SB和COG-LL-356h）是爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）转化的B细胞系，它们组成了第四个表型组。为了确定各细胞系的差异表达（DE）蛋白，使用差异表达定量质谱法（DEqMS）进行定量蛋白质组学比较。首先，在B细胞和T细胞系之间进行了定量分析，排除了EBV转化的B细胞系，随后进行了基因集富集分析（GSEA），指出了各系的B细胞受体或T细胞受体信号通路（补充图1c）。
按细胞遗传背景分层，数据集被证实反映了已知标记物和途径的富集情况。在蛋白质组学数据集中，已知作为白血病驱动病变或特征的融合蛋白被富集，包括TCF3-PBX1融合的PBX1、ROR1和WNT1626，以及BCR-ABL1、NUP214-ABL1和SPFQ-ABL1融合的ABL1（图1d）。其他与特定易位相关的已知标记也可以被检测到，包括ETV6-RUNX127,28的IGF2BP1和PIK3C3，以及KMT2A/混合线白血病的MEIS1（图1d和补充图1d）。此外，利用ALL患者样本的转录组学数据对选定的亚型进行了DE分析，并将其与细胞遗传亚型匹配的细胞系中差异丰富的蛋白质进行比较，结果显示临床患者样本和细胞系之间有很好的一致性（补充图1e）。这些结果表明，这些细胞系保留了临床ALL患者样本的分子特征。
02 - ALL蛋白质组和转录组的相关性分析
作者对所有mRNA-蛋白质对（n = 8981）进行了Spearman配对相关，相关系数的中位数为0.55（图2a）。为了评估在与各自的mRNA定量不同的水平上检测到的蛋白质的功能影响，用Spearman相关系数排列的列表来确定最高和最低相关对的富集的KEGG途径。高度相关的mRNA-蛋白对属于专门的信号转导途径，如B细胞和T细胞受体信号转导途径中的NFKB1和LCK，而相关性差的配对属于管家功能，如剪接体和核糖体过程中的SRSF2和RPL5（图2b）。
作者使用从CORUM获得的蛋白质复合体成员的数据集来证明，相对于随机对而言，在蛋白质水平比在转录本水平，复合体成分之间发生更高的成对相关性（图2c）。与以前的研究一致，发现miRNA靶向、亚细胞定位和蛋白质降解在塑造复合体成员的蛋白质丰度方面有类似的趋势，反映了转录后和翻译后机制的累积和互补效应。
在上述一般机制的同时，作者检测到了与突变状态和复合体成员有关的蛋白质-RNA比率的独特分子指纹。对于有GINS2突变（P19S）35的REH细胞系，GINS-复合物成员的蛋白-mRNA差异明显大于其他细胞系中相应的蛋白-mRNA对的差异。这表明该突变可能对整个蛋白复合物的调节或功能产生影响，而这种影响只在蛋白质组水平上表现出来。数据暗示了复合物形成的潜在障碍，这将导致其他GINS成员的附带降解（图2d）。
考虑到经常参与ALL启动和进展的标志物，MTOR、AKT2和KMT2D显示出较差的mRNA-蛋白质相关性，而TP53没有显示出相关性（图2e）。这与之前的观察结果一致，即KMT2D截断突变影响蛋白质水平，但不影响转录本水平。来自B细胞和T细胞受体KEGG途径的标志物显示了类似的模式，mRNA-蛋白质的相关范围很广。这些数据进一步支持了转录物水平分析允许对标记物的蛋白水平丰度进行不精确的解释。
03 - 蛋白质组和转录组概况的表型和聚类分析
使用高变异蛋白质（n = 3282）对蛋白质组进行共识聚类，表明有七个不同的聚类。包括所有样品和蛋白质的层次聚类将细胞系分层为共识白血病集群（CLC）（图3a，补充图3a-c）。CLC1包含有ETV6-RUNX1、BCR-ABL1、KMT2A-MLLT1和IGH-MYC基因融合的细胞系。CLC2主要由TCF3重排的ALL细胞系（TCF3- PBX和TCF3-HLF）以及几个具有以前未指定的细胞遗传背景的细胞系组成。CLC3包含22个T-ALL细胞系中的16个，同样具有不同的细胞遗传背景，与聚集在CLC7中的其他6个T-ALL细胞系相比，其特点是G2M检查点标志、较高的剪接体和较高的E2F靶点活性。
鉴于共转录调控机制与剪接体的组装和降解有关，作者对CLC3和CLC7之间的转录组学数据进行了DE分析，然后进行GSEA分析，结果未能再现剪接体的上调（图3b）。改变剪接图谱和不同的剪接已经牵涉到药物和治疗的抗性和ALL39-41，这些结果为使用蛋白质组来量化ALL的关键标志物的价值提供了进一步的支持。
为了更好地了解两个不同谱系之间的相对差异，对每个谱系单独进行了聚类。这确定了B系（B-CLC）的五个聚类和T系（T-CLC）细胞系的七个聚类（图3c）。此外，对转录组学数据进行了共识聚类，将B系和T系分别细分为六个和五个不同的亚群（图3d）。其中三个具有KMT2A重排亚型的细胞系被归入RNA簇4，一个被归入RNA簇1，而蛋白质组学聚类将这些细胞系分为三个不同的蛋白质组簇（B-CLC1、B-CLC3和B-CLC5），表明蛋白质组学分析提供了一个额外角度来揭示表型差异，这可能具有临床意义。在两种KMT2A重排亚型之间进行了DEqMS分析，并在KMT2A-AFF1细胞系中确定了p53是上调最多的蛋白质（图3e），表明KMT2A重排细胞系之间的p53调节网络存在差异。此外，两个ETV6-RUNX1细胞系被归入同一个RNA簇（簇3），但被归入不同的蛋白质组簇（B-LC2和B-LC5）。
为了评估细胞系的系谱状态，使用已建立的B细胞和T细胞发育阶段的细胞标志物对BCP-ALL和T-ALL细胞系进行免疫分型（补充图3d）。对于T-ALL细胞系，发现双阴性（DN）和双阳性（DP）的分化阶段被专门分开在不同的集群中。在T-ALL集群中，T-CLC1、T-CLC2和T-CLC3是由皮质DP细胞系或免疫分型不明确的细胞系组成，而T-CLC5、T-CLC6和T-CLC7包含DN前体细胞系（补充图3e，f）。尽管TAL1和LYL1是用于临床T-ALL分层的主要亚型标记，但相对于其他DN或DP细胞系，具有这些标记的细胞系在我们的聚类中没有表型上的区别。
在B细胞状态的分配中，一些细胞遗传学亚型似乎局限于一种B细胞状态，而其他的则占据了多种细胞状态和蛋白质组群（补充图3g，h）。TCF3-PBX1和MEF2D-HNRNPUL1细胞系被确定为统一的B细胞状态分配，所有的样本分别被归类为前B型或早期前B型，这表明这些融合可能与一个停滞的细胞状态有关。B-CLC2和B-CLC3是由显示前B或前B系特征的细胞系定义的，而且还显示了维持B系的转录因子PAX5的高相对丰度。相反，B-CLC1和B-CLC5似乎没有共同的系谱表型。然而，B-CLC1表现出FLT3的明显富集，FLT3是一种对临床结果有致病作用的造血特征，通常与儿童ALL45的白血病驱动突变有关。B-CLC5含有这种蛋白最丰富的细胞系（COG-LL-355h，380，MHH-CALL-4）。此外，B-CLC5的特点是粘附分子CEACAM1的丰度，它通过与TIM347的相互作用诱导产生耐受性的免疫环境，表明对致癌免疫调节有共同的保留亲和力。
04 - 儿童ALL细胞系对一组528种肿瘤药物的药物敏感性
作者对43个细胞系进行了DSRT，针对528种FDA批准的和正在研究的肿瘤药物，在5个浓度下进行研究。选择性药物敏感性评分（sDSS）是通过将药物敏感性与正常骨髓（BM）49的药物反应正常化而得到的（图4a）。
广谱细胞毒药物，如常规化疗药物在大多数测试的细胞系中表现出高活性（图4b）。许多激酶抑制剂（也在大多数测试的细胞系中表现出高活性，而不论细胞遗传亚型或血统如何。许多细胞系对p53-MDM2拮抗剂都很敏感，只有一组细胞系对这些拮抗剂一直有抵抗力，其中KMT2A-AFF1细胞系（ALL-PO和SEM）怀疑p53通路失调，可能是由于TP53的突变或其他基因融合导致的调节障碍。
大多数细胞系对地塞米松、泼尼松龙和甲基泼尼松龙表现出相当的敏感性，但有12个细胞系除外，其中REH和JURKAT细胞系，它们以前被证明对地塞米松有抗性。对GCs的敏感性与糖皮质激素受体（NR3C1）的蛋白丰度有很好的相关性（图4c），与患者对GCs的有利反应和ALL和骨髓瘤中NR3C1的基础表达水平之间的关系一致。
作者使用每种药物的假定药物靶点蛋白列表，对每种药物及其假定药物靶点的药物敏感性-蛋白丰度的皮尔逊相关性进行排序，以检查靶点丰度和药物反应之间的关系（图4d）。在该分析中排名较高的药物中，几个酪氨酸激酶抑制剂和受体酪氨酸激酶抑制剂分别与它们的假定靶点ABL1和FLT3的蛋白丰度有良好的相关性（图4d）。此外，PARP1抑制剂与PARP1水平很相关（图4d）。MDM2抑制剂与MDM2丰度呈正相关，而与MDM2降解的目标p53呈反相关（图4d）。
他克莫司是一种大环内酯，对12个ALL细胞系有效。尽管FKBP1A在这种作用机制（MoA）中起着关键作用，但发现FKBP1A的丰度与他克莫司的敏感性呈负相关。然而，顺反式脯氨酰异构酶家族的另一个成员FKBP10与他克莫司的敏感性密切相关（图4e）。这种意外的相关性表明，FKBP10值得进一步研究它与他克莫司的结合和活性情况。
05 - 儿童ALL细胞系中的药物活性机制
作者用转录组学和蛋白质组学数据进行了成对的药物敏感性相关分析，使用至少两个细胞系（n = 281）中sDSS≥8的药物进行分析。累积起来，相对蛋白质丰度与sDSS的相关性明显高于蛋白质编码的mRNA水平（补充图5a）。
对于每种药物，至少对两个细胞系有效（sDSS>8），与药物敏感性相关的蛋白质的皮尔逊相关值矩阵被用作输入，使用UMAP进行降维。(图5a）。注意到在UMAP空间中，许多药物靶点家族，如ABL1、HDAC、BCL2和PI3K抑制剂有密切的联系（图5b）。对于这些药物类别，检查了与同类药物分散的异常值，注意到选择性I类HDAC抑制剂tacedinaline与其他I类HDAC靶向药物严重分散。此外，TCF3- PBX1融合细胞系对tacedinaline表现出抗性，尽管对大多数其他HDAC抑制剂有反应（图5c）。
为了研究tacedinaline的吸收和细胞内浓度是否在敏感和耐药的细胞系中有所不同，调查了tacedinaline与HDAC1的细胞内靶向接触。使用细胞系KOPN-8（KMT2A-MLLT1，对tacedinaline敏感）和RCH-ACV（TCF3-PBX1，对HDACi敏感，对tacedinaline耐药），用细胞热转移试验（CETSA）监测HDAC1的参与情况。在敏感和耐药的细胞中，tacedinaline处理使HDAC1热稳定的程度相似（约4℃），而且tacedinaline在一定浓度范围内具有同等的目标参与（图5d）。这些观察结果表明，尽管有效的靶向参与，但tacedinaline与同类的其他抑制剂不同，它在那些对HDAC抑制敏感的细胞系中赋予了抗性。
在UMAP空间中也可以看到具有不同拟议分子靶点的药物的密切关联，作者通过检查sDSS之间的相关性证实了这些药物-药物关联。对ERBB2抑制剂mubritinib的敏感性与HIF1A抑制剂BAY-87-2243和VCP/p97抑制剂NMS-873相关（图5b）。这些药物有一个共同的替代分子靶点，即呼吸道复合物I68-70。此外，发现对这些药物的敏感性和蛋白酶体亚单位的丰度之间存在强烈的正相关关系（补充图5b，c），表明消耗ATP的高蛋白周转率是一个与敏感性相关的共同分子特征。
在本研究数据集中，大多数细胞系对广义的BCL2家族成员抑制剂非常敏感（补充图5d，e），但对于BCL家族成员的选择性抑制剂，BCP-ALL和T-ALL细胞系根据其敏感性特征进行了区分。BCP-ALL细胞系对选择性BCL2抑制剂venetoclax非常敏感，而T-ALL细胞系则对BCL2L1选择性抑制剂A-1155463和A-1331852敏感（图5e）。venetoclax和A-1155463的敏感性分别与它们的靶蛋白BCL2和BCL2L1的丰度很相关，而不完全与世系有关（图5f）。
竞争性PDPK1抑制剂和OSU-03012（AR-12）是另一种具有系别特异性的靶向药物（图5e），结果表明在大多数T-ALL细胞系和BCP-ALL细胞系的一个亚群中具有很好的敏感性。在T-ALL细胞系中，OSU-03012敏感性的最佳相关蛋白是IL9R，然而在BCP-ALL细胞系中，IL9R与敏感性不相关，敏感性与PDPK1蛋白丰度明显负相关。此外，STRING网络数据库中没有PDPK1相互作用的蛋白与BCP-ALL的药物活性相关（图5g），对于相关的PDPK1途径的标记物，也没有发现明显的正相关关系。本研究数据集在BCP-ALL中发现了与HSP90（HSP90AB1，图5h）的明显相关性。此外，在最高度相关的蛋白质中，有许多含有伴侣素的TCP1复合物（CCT复合物）的成分（图5h），该复合物执行ATP依赖性的多肽链折叠。通过对该复合物的功能干扰而产生的药物活性也与以前描述药物治疗后诱导ER应激的数据相一致，这些关联表明CCT复合物也可以作为OSU-03012的一个潜在目标被进一步研究。此外，通过药物相关性评估，OSU-03012与ATP-类似物HSP70家族抑制剂VER-155008在BCP-ALL细胞系中存在相关性，但在T-ALL细胞系中没有相关性。这进一步表明，OSU-03012的敏感性与BCP-ALL细胞系中对伴侣蛋白的依赖有关。
为了进一步量化与血统有关的差异，作者使用了差异相关分析（DCA），应用于BCP-ALL或T-ALL细胞系的sDSS-蛋白丰度相关性。发现硫氧还蛋白TXNDC9的丰度与许多临床相关的化疗药物和拓扑异构酶抑制剂，包括拉替曲塞、吉西他滨和SN-38呈相反的方向明显相关（补充图5f）。对于BCP-ALLs，该蛋白的丰度增加与敏感性相关，但对于T-ALLs，该蛋白的丰度与抗性明显相关（补充图5g）。众所周知，硫氧还蛋白在调节蛋白酶体和氧化还原代谢方面发挥着不同的功能，因此进一步探索和表征TXNDC9的相互作用物可以揭示出与血统相关的生物学差异。TXNDC9的一个公认的结合伙伴是CCT-复合物，在BCP-ALL细胞系中，TXNDC9的丰度与所有CCT-复合物成员的丰度明显相关，但在T-ALL细胞系中则不然。这表明TXNCD9和CCT-复合物之间的相互作用更可能发生在BCP-ALLs中，其中TXNDC9的丰度与化疗敏感性而不是化疗抗性相关。
06 - MEF2D重新排列的细胞系的表型特征和药物敏感性
在对细胞遗传亚型、蛋白质组聚类、药物敏感性和细胞状态的分析中，观察到一组由MEF2D-HNRNPUL1融合基因区分的细胞系之间存在惊人的相似性。在儿童ALL的情况下，MEF2D已被发现与至少六个不同的融合伙伴融合。MEF2D重排的细胞遗传亚型与相对较差的临床结果有关。
MEF2D重组的白血病显示出独特的基因表达特征，与MEF2D-HNRNPUL1细胞系中不同含量的蛋白质有很大的重叠和一致（图6a，补充图6a）。从表型上看，当通过转录组学或蛋白质组学分析时，这些细胞系聚集在一起，细胞状态评估将它们统一定为早期前B细胞（补充图6c）。DEqMS分析发现，与其他BCP-ALL细胞系相比，MEF2C和HDAC9属于差异丰度最高的蛋白质（图6b，补充图6b），表明它们可能也对广义的I类HDAC抑制剂敏感。然而，发现与其他BCP-ALL细胞系相比，其敏感性没有明显差异（补充图6d）。为了进一步研究这个问题，使用了TMP269，一种强效的IIa类HDAC抑制剂，对HDAC991的IC50为23 nM，发现在任何测试的细胞系中都没有抑制作用（补充图6d）。这表明HDAC9可能不是一个可治疗的弱点，至少在携带MEF2D-HNRNPUL1融合体的患者中是白血病细胞内在的毒性。
与它们对HDAC抑制剂缺乏特异性敏感性相反，相对于其他BCP-ALL细胞系，三个带有MEF2D-HNRNPUL1融合体的儿童ALL细胞系表现出对 Bryostatin-1独特的强大和特异性敏感性（图6c）。成年MEF2D-HNRPUL1融合细胞系KASUMI-7的DSRT分析也显示出对Bryostatin-1的明显敏感性。通过评估与sDSS高度相关的蛋白质组标志物，观察到bryostatin-1的毒性与MEF2D-HNRNPUL1细胞系中上调的标志物之间存在强烈的相关性（图6d）。
其中一个正相关的标志物是RASGRP1，它已被确定为前B细胞对负选择敏感性的直接媒介。作为在早期前B细胞阶段表达了前B细胞受体的细胞，本研究MEF2D融合细胞系处于一个发展阶段，可能使它们容易受到负选择的影响。为了支持对这种负选择途径的潜在操纵，观察到MEF2D融合细胞具有丰富的DAG降解酶DGKH（图6b）。
作者评估了ryostatin-1作为一种DAG类似物，是否通过激活这种促凋亡ERK信号来发挥作用。在100nM bryostatin-1处理2小时后，观察到与DMSO处理的对照组相比，磷酸化的ERK的丰度明显增加（图6e）。
为了验证bryostatin-1作为DAG类似物的靶向作用，评估了MEF2D-HNRPUL1细胞系是否对另一种DAG类似物--乙酸山梨醇酯（PMA）敏感。PMA在MEF2D-HNRNPUL1细胞系中也赋予了强大的毒性（图6f），这种影响在MEF2D-HNRNPUL1细胞系中明显比其他测试的BCP-ALL细胞系更强，这表明Bryostatin-1的目标效应被PMA复制了。为了进一步确认ERK信号是毒性的媒介，通过使用MEK抑制剂tramatenib、UO126、selumetinib和ERK抑制剂ERK 11e阻断ERK途径（磷酸化）。在用100nM bryostatin-1或25nM PMA处理的细胞中，同时用1uM的MEK或ERK抑制剂，所有测试的抑制剂都能显著提高存活细胞数（图6g和补充图6e）。除UO126外，单独用1uM MEK或ERK抑制剂处理，导致MEF2D-HNRPUL1融合细胞系的存活率轻微但明显下降，进一步支持针对ERK磷酸化的药物在纠正DAG类似物毒性方面特别有利于存活率（补充图6f）。
四、结论
作者对49个儿童ALL细胞系进行了蛋白质组学指导下的分析，产生了全面的生物标志物和药物敏感性资源，并确定了针对MEF2D-HNRNPUL1重排的高风险亚群的潜在治疗漏洞。还提供了一个用户友好的网络应用，用于探索本研究中描述的蛋白质组、转录组和药物敏感性数据。